Uji koagulase: alasan, prosedur, dan kegunaan

Uji koagulase: alasan, prosedur, dan kegunaan

Uji koagulase adalah teknik laboratorium yang digunakan untuk menunjukkan adanya enzim koagulase. Enzim ini memiliki sifat koagulasi plasma. Loeb pada tahun 1903 adalah orang pertama yang mendeskripsikan enzim ini.

Tes ini dilakukan pada kokus Gram-positif, katalase-positif, memungkinkan strain Staphylococcus aureus untuk dibedakan dari stafilokokus lainnya, karena ini adalah satu-satunya mikroorganisme penting secara klinis yang memproduksinya.

Tes koagulase

Kedua gambar menunjukkan Tes Koagulase positif. Sumber: Gambar kiri: Philippinjl [CC BY-SA 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/)]. Gambar kanan: Foto diambil oleh penulis MSc. Marielsa Gil.

Dalam pengertian ini, anggota Keluarga Staphylococaceae yang hasil tesnya negatif sering disebut sebagai Staphylococcus koagulase negatif.

Ada beberapa strain selain S. aureus yang dapat menghasilkan koagulase, seperti Staphylococcus schleiferi spp coagulans, S. hyicus, S. intermedius dan S. delphini.

Namun, tiga yang pertama memiliki kepentingan klinis di tingkat veteriner dan sangat jarang ditemukan sebagai agen penyebab infeksi pada manusia, sedangkan S. delphini hanya ditemukan di lingkungan laut.

Lebih lanjut, mereka mudah dibedakan karena S. hyicus dan S. intermedius tidak memfermentasi manitol dan koagulan S. schleiferi spp tidak memfermentasi maltosa atau trehalosa, sedangkan S. aureus memfermentasi karbohidrat ini.

Kehadiran enzim koagulase telah dikaitkan dengan virulensi strain. Namun, teori ini telah runtuh, karena spesies koagulase-negatif virulen lainnya yang mampu menghasilkan infeksi signifikan diamati.

Indeks artikel

Dasar

Staphylococcus aureus menghasilkan dua jenis koagulase, satu yang tetap melekat pada dinding sel, juga disebut faktor aglutinasi atau faktor koagulase reaktif (CRF), dan ekstraseluler yang dilepaskan dalam kultur cair. Itulah mengapa mereka masing-masing disebut koagulase terikat dan koagulase bebas.

Enzim koagulase berutang namanya untuk tindakan yang dihasilkannya. Ini memiliki kemampuan untuk mengubah fibrinogen menjadi fibrin, menciptakan bekuan yang jelas ketika ditemukan dalam plasma, yaitu, enzim ini mensimulasikan aktivitas trombin dari kaskade koagulasi.

Faktanya, salah satu teori yang paling banyak diterima adalah bahwa koagulase terikat bereaksi dengan koagulase bebas untuk mengaktifkan faktor pembekuan. Aktivasi ini menghasilkan zat yang bertindak dengan cara yang sama seperti protrombin, menciptakan senyawa dengan fungsi trombin.

Perbedaannya dengan kaskade koagulasi normal adalah bahwa reaksi ini tidak memerlukan adanya kalsium dan tidak dipengaruhi oleh heparin.

Untuk melakukan uji koagulase, cukup dengan menghadapi kultur segar Staphylococcus dengan plasma kelinci lebih disukai dan dengan demikian mengamati pembentukan atau tidak dari bekuan.

Ada teknik khusus untuk mendeteksi koagulase terikat dan koagulase terikat dan bebas secara bersamaan.

Beberapa galur S. aureus positif lebih cepat daripada yang lain. Laju pembentukan bekuan berbanding lurus dengan konsentrasi koagulase yang ada.

Uji geser koagulase mendeteksi koagulase terikat dan uji tabung mendeteksi koagulase terikat dan koagulase bebas.

Proses

-Tes koagulase geser

bahan

-Bersihkan slide

-Plasma kelinci lebih disukai, plasma manusia atau kuda juga dapat digunakan. Plasma dapat dibeli secara komersial diliofilisasi dan dilarutkan untuk digunakan, atau dapat digunakan segar (segar). Alternatif lain yang layak adalah penggunaan fibrinogen.

-Larutan garam steril (0,85%) (SSF).

Memperoleh plasma segar

Ambil darah vena manusia atau hewan. Ini dapat menggunakan salah satu antikoagulan berikut: EDTA, kalsium oksalat, heparin atau natrium sitrat. Aduk rata dan centrifuge. Keluarkan supernatan (plasma) secara aseptik, tanpa sel darah merah dan tempatkan dalam tabung steril.

Plasma

Pemisahan Plasma. Sumber: foto diambil oleh penulis: MSc. Marielsa Gil.

Plasma terliofilisasi

Susun kembali seperti yang ditentukan pada botol kit komersial.

Fibrinogen segar

Menggunakan plasma sitrat, campur plasma dalam bagian yang sama dengan larutan natrium klorida jenuh. Biarkan mengendap dan centrifuge.

Buang supernatan, susun kembali endapan hingga 5 kali volumenya dengan air suling steril. Tambahkan 5 unit heparin untuk setiap ml fibrinogen. Simpan dalam tabung steril.

Teknik

Satu tetes larutan garam dan satu tetes plasma ditempatkan pada kaca objek secara terpisah. Ambil 1 atau 2 koloni murni mikroorganisme untuk diuji dengan platina loop.

Campur beban bakteri dalam tetesan plasma dan ulangi operasi pada tetesan SSF. Amati hasilnya segera. Hasil positif akan menjadi salah satu di mana pembentukan aglutinat makroskopik (endapan putih) diamati setelah satu menit di sisi tetes plasma.

Penurunan SSF berfungsi sebagai kontrol negatif. Jika aglutinasi diamati dengan SSF, ini berarti bahwa mikroorganisme mengaglutinasi sendiri, yang dapat memberikan hasil positif palsu. Dalam hal ini harus dikuatkan dengan uji tabung.

Juga direkomendasikan untuk memasang kontrol positif dengan strain S. aureus yang diketahui .

Penafsiran

Aglutinasi dalam 5-20 detik (tes positif kuat).

Aglutinasi variabel terjadi antara 20 detik dan satu menit (tes positif tertunda).

Beberapa derajat aglutinasi setelah satu menit (bukti yang meragukan). Disarankan untuk mengulang tes atau konfirmasi dengan metode tabung.

Tidak ada aglutinasi (tes negatif).

Hasil dengan SSF. Itu harus selalu memberikan negatif, jika memberikan positif secara otomatis hasil tes tidak valid.

Koagulase -Tube uji

bahan

-Tabung reaksi steril

-Plasma

-Bath of Mary pada 37 ° C.

Teknik

Pipet 0,5 ml plasma ke dalam tabung reaksi 12 x 75 steril. Masukkan loop platinum dengan 2 hingga 4 koloni murni untuk dipelajari dari kultur padat selama 18 hingga 24 jam dan larutkan dalam plasma. Campur dan inkubasi dengan hati-hati pada suhu 37 ° C selama 4 jam.

Periksa tabung di jam pertama tanpa mengocoknya, cukup miringkan dengan lembut. Jika bekuan masih belum terlihat, dapat terus diamati setiap 30 menit sampai 4 jam selesai. Jika setelah 4 jam masih negatif, bisa dibiarkan hingga 24 jam tetapi pada suhu kamar. Amati dan laporkan hasilnya.

Berdasarkan pengalaman, beberapa ahli mikrobiologi merekomendasikan penggunaan 500 l suspensi bakteri dari kultur 18 jam dalam media cair untuk melakukan pengujian.

Tampaknya menawarkan hasil yang lebih cepat dan lebih dapat diandalkan daripada ketika mengemulsi koloni dari media padat, terutama jika plasma manusia yang diperoleh dari bank darah telah digunakan.

Penggunaan strain dari kaldu membantu untuk mengencerkan kemungkinan adanya antibodi anti-staphylococcal manusia dalam plasma yang dapat menghambat aksi koagulase.

Penafsiran

Jika terlihat gumpalan yang menutupi semua cairan (pembekuan lengkap) atau gumpalan tanpa sisa cairan (pembekuan parsial), itu harus dianggap sebagai tes positif.

Jika tidak ada gumpalan yang terbentuk, yaitu suspensi tetap homogen, tesnya negatif.

-Tes koagulase menggunakan fibrinogen

Fibrinogen digunakan sama seperti plasma dan cocok untuk uji slide dan tabung. Lanjutkan seperti yang dijelaskan untuk plasma dan interpretasikan dengan cara yang sama.

Menggunakan

Ini digunakan untuk membedakan Staphylococcus aureus dari staphylococci koagulase negatif.

QA

Sediakan kultur segar dari galur S. aureus untuk digunakan sebagai kontrol positif. Strain S. epidermidis juga tersedia sebagai kontrol negatif.

Keterbatasan

-Tes positif tidak boleh dibiarkan dalam inkubasi selama 24 jam, karena S. aureus menghasilkan fibrinolisin yang melarutkan bekuan darah.

-Untuk tes yang andal, plasma segar atau yang baru dilarutkan harus digunakan, serta penting untuk menggunakan kultur bakteri segar (18 hingga 24 jam). Ini menghindari negatif palsu.

-Tes harus dilakukan bersama-sama dengan kontrol negatif dan positif.

-Beberapa media padat dapat mengganggu uji koagulase. Tidak dianjurkan untuk menggunakan koloni dari agar manitol asin.

-Jika plasma sitrat digunakan, dianjurkan untuk menempatkan 5 unit heparin per ml plasma untuk menghindari positif palsu. Ini karena beberapa mikroorganisme selain S. aureus dapat memecah sitrat dan menyebabkan plasma menggumpal. Dalam hal ini disarankan untuk melakukan tes Gram dan katalase.

-Penting, dalam uji tabung, untuk memantau reaksi setiap 30 menit, karena ada galur S. aureus yang menghasilkan fibrinolisin konsentrasi tinggi dan akan mengencerkan bekuan yang baru terbentuk dengan cepat. Hindari negatif palsu.

-Saat memantau tes, hindari mengocok tabung secara tiba-tiba, ini dapat menghancurkan awal pembentukan bekuan yang tidak akan dipulihkan nanti, menyebabkan negatif palsu.

Referensi

  1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosa Mikrobiologi. edisi ke-5. Editorial Panamericana SA Argentina.
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnosa Mikrobiologi Bailey & Scott. 12 edisi Editorial Panamericana SA Argentina.
  3. Mac Faddin J. (2003). Tes biokimia untuk identifikasi bakteri yang penting secara klinis. edisi ke-3 Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
  4. Laboratorium Pro Lab. Kelinci mengkoagulasi plasma. Tersedia di: pro-lab.com
  5. “Koagulase.” Wikipedia, Ensiklopedia Bebas . 12 Februari 2019, 04:23 UTC. 22 Apr 2019, 15:50 wikipedia.org.