Metode Bradford adalah metode kolorimetrik umum digunakan untuk estimasi cepat konsentrasi protein total dalam sampel biologis eksperimental. Ini digunakan di berbagai bidang biologi, medis, kedokteran hewan, penelitian agronomi, dll.
Dikenal sebagai “metode Bradford” karena pertama kali dijelaskan oleh Marion Bradford pada tahun 1976, dalam publikasinya yang berjudul A Rapid and Sensitive Method for the Quantification of Proteins in Microgram Quantities Using the Protein-Dye Binding Principle .
Foto piring dari Elisa tempat sampel dari kuantifikasi Bradford telah disiapkan (Sumber: Helito, CC BY-SA 4.0 <https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0>, melalui Wikimedia Commons)
Sejak diusulkan, metode ini menjadi sangat populer, karena diakui lebih sensitif daripada metode kuantifikasi protein lainnya (seperti metode Lowry dan Biuret, misalnya); Ini membentuk kompleks yang lebih stabil dari waktu ke waktu dan tidak mahal serta mudah dilakukan.
Selanjutnya, reagen yang Anda gunakan telah terbukti memiliki sedikit gangguan dalam pengukuran spektrofotometri dalam kondisi yang berbeda.
Indeks artikel
Prinsip metode
Metode Bradford didasarkan pada kuantifikasi perubahan warna dalam larutan karena penyatuan – dalam kondisi asam – molekul protein sampel dengan molekul pewarna khusus: Coomassie Blue Brilliant Blue G250.
Ketika pewarna ini ditambahkan ke larutan protein, ia mengikat molekul-molekul ini melalui gaya elektrostatik dan reaksi ini dibuktikan sebagai perubahan warna dari coklat kemerahan menjadi biru.
Protein dan asam amino
Sama seperti tubuh terdiri dari banyak sel dan asam nukleat (seperti DNA dan RNA) terdiri dari nukleotida, protein terdiri dari urutan molekul yang dikenal sebagai asam amino.
Asam amino adalah molekul yang terdiri dari atom karbon pusat di mana 4 gugus kimia yang berbeda melekat: atom hidrogen, gugus karboksil, gugus amino dan gugus atau rantai samping, yang memberikan identitasnya.
Ada 20 asam amino yang umum untuk semua protein, yang berbeda satu sama lain mengenai sifat-sifat gugus sampingnya: ada asam amino basa, asam, polar, apolar, siklik, aromatik, dll.
Jumlah karakteristik asam amino ini dan urutannya untuk membentuk struktur protein memberikan setiap protein serangkaian karakteristik fisikokimia tertentu, baik dalam hal muatannya, massanya, hidrofobisitasnya, dan lain-lain.
Kompleks pewarna-protein
Metode Bradford, kemudian, mengukur keberadaan residu asam amino dari karakteristik dasar dalam sampel biologis, terutama asam amino seperti arginin, lisin dan histidin, yang paling mudah dikomplekskan dengan Coomassie blue.
Perubahan warna dikuantifikasi sebagai variasi absorbansi sampel, yang diukur menggunakan spektrofotometer yang disesuaikan dengan panjang gelombang 595 nm.
Apa itu absorbansi?
Juga dikenal sebagai kerapatan optik , ini mendefinisikan jumlah cahaya yang diserap oleh larutan. Penyerapan tersebut bergantung pada panjang gelombang cahaya yang digunakan untuk menyinari larutan, karena tidak semua molekul mampu menyerap pada panjang gelombang yang sama.
Fenomena ini diringkas dalam hukum yang dikenal sebagai Hukum Beer-Lambert, yang menetapkan hubungan antara penurunan jumlah cahaya yang melewati suatu zat dan sifat-sifat zat tersebut.
Misalnya, ketika cahaya ditransmisikan melalui larutan, ada dua pengukuran intensitas: intensitas datang (sebelum melewati larutan) dan intensitas yang ditransmisikan (umumnya lebih rendah, yang sesuai dengan fraksi cahaya yang tidak diserap oleh larutan) .
Hubungan antara kedua nilai inilah yang dikenal dengan formalitas dan memiliki nilai antara 0 dan 1 atau dinyatakan dalam persentase.
Absorbansi terkait dengan transaksi dalam cara logaritmik, dan hukum Beer-Lambert mengusulkan hubungan linier antara absorbansi larutan dan konsentrasinya, koefisien kepunahan molarnya dan koefisien optik larutan; Persamaan matematis yang menjelaskan hukum ini adalah sebagai berikut:
A (absorbansi) = (koefisien pemadaman molar) c (konsentrasi) l (panjang jalur cahaya)
Konsentrasi larutan dihitung dengan menyelesaikan yang tidak diketahui tersebut dari persamaan dan melakukan perhitungan yang bersangkutan (c = A / l)
Apa itu spektrofotometer?
Ini adalah perangkat yang digunakan untuk mengukur jumlah cahaya (berdasarkan panjang gelombang) yang diserap molekul dalam larutan atau, dengan kata lain, jumlah cahaya yang mereka biarkan.
Spektrofotometer bekerja dengan memancarkan seberkas cahaya (tampak atau ultraviolet) yang melewati prisma (atau perangkat yang dikenal sebagai monokromator kisi difraksi ) yang memecahnya menjadi panjang gelombang berbeda yang menyusunnya, memungkinkannya untuk “memilih” panjangnya. khususnya.
Cahaya ini dilewatkan melalui tabung khusus yang berisi sampel yang dianalisis dan selanjutnya mencapai detektor yang mendeteksi jumlah cahaya yang ditransmisikan dari sampel tersebut (yang tidak diserap), yang kemudian dapat diamati berkat ” Interpreter” yang memiliki antarmuka grafis .
Warna: Coomassie Brilliant Blue G 250
Reagen yang paling penting dalam metode ini tidak diragukan lagi adalah pewarna yang digunakan untuk “menandai” protein dalam sampel. Bradford mengusulkan penggunaannya karena pewarna ini ada dalam dua bentuk: satu merah dan satu biru. Bentuk merah menjadi bentuk biru setelah pewarna mengikat protein, membentuk kompleks.
Kompleks protein biru Coomassie memiliki koefisien kepunahan molar yang sangat tinggi, yang menghasilkan sensitivitas yang lebih tinggi untuk kuantifikasi konsentrasi protein dalam sampel yang dianalisis.
Reagen
Meskipun larutan yang digunakan untuk metode kuantifikasi ini umumnya dijual dalam wadah tertutup, sudah disiapkan – “reagen Bradford” -, reagen utama yang digunakan adalah:
– Coomassie Brilliant Blue G50 (0,01% b / v)
– Asam fosfat (8,5% b / v)
– Etanol (4,7% b / v)
Kit untuk kuantifikasi protein dengan metode Bradford (Sumber: Viv Rolfe, CC BY-SA 4.0 <https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0>, melalui Wikimedia Commons)
Seperti dalam metode dan protokol apa pun untuk kuantifikasi protein dengan metode spektrofotometri, perlu untuk memiliki protein “standar” atau “standar” untuk melakukan kurva kalibrasi untuk menentukan nilai absorbansi relatif terhadap konsentrasi protein yang berbeda; albumin serum sapi umumnya digunakan.
Metode ini terdiri dari pencampuran volume tertentu dari masalah sampel dengan volume tertentu reagen Bradford; tunggu beberapa menit hingga interaksi zat warna-protein terjadi dan perubahan warna terlihat jelas lalu ukur dan catat nilai absorbansinya untuk melakukan perhitungan selanjutnya.
Penggunaan / aplikasi
Metode Bradford adalah salah satu metode kuantifikasi atau estimasi konsentrasi protein yang paling banyak digunakan di dunia, terutama karena biayanya yang rendah, kecepatan hasil yang diperoleh, stabilitas yang baik antara protein dan pewarna yang digunakan, reproduktifitasnya dan interferensi minimum yang dimiliki komponen reagen yang digunakan selama pengukuran.
Metode ini digunakan dalam ratusan aplikasi ilmiah yang berbeda untuk penentuan protein dalam konteks yang berbeda: fisiologis, sitologis, imunologis, klinis, industri (khususnya dalam industri makanan), dll.
Secara eksperimental, metode ini sangat berguna untuk:
- Pantau jumlah protein yang terkandung dalam volume yang diperoleh secara progresif dari kolom kromatografi (dalam afinitas, pertukaran ion, penyerapan, kolom filtrasi gel, antara lain) yaitu menganalisis fraksi dari protokol pemurnian protein.
- Pantau jumlah protein yang dimasukkan ke dalam gel untuk elektroforesis.
- Perkirakan jumlah protein yang diperoleh dalam sistem ekspresi berlebih.
Referensi
- Bonjoch, NP, & Tamayo, PR (2001). Kuantifikasi kandungan protein dengan metode Bradford. Dalam Buku Pegangan Teknik Ekofisiologi Tumbuhan (hlm. 283-295). Springer, Dordrecht.
- Bradford, MM (1976). Metode cepat dan sensitif untuk kuantisasi jumlah mikrogram protein dengan menggunakan prinsip pengikatan pewarna protein. Biokimia analitik, 72 (1-2), 248-254.
- Kielkopf, CL, Bauer, W., & Urbatsch, IL (2020). Bradford assay untuk menentukan konsentrasi protein. Protokol Pelabuhan Mata Air Dingin, 2020 (4), pdb-prot102269.
- Sapan, CV, Lundblad, RL, & Price, NC (1999). Teknik uji protein kolorimetri. Bioteknologi dan Biokimia Terapan, 29 (2), 99-108.
- Walker, JM (Ed.). (seribu sembilan ratus sembilan puluh enam). Buku pedoman protokol protein (Vol. 1996). Ilmu Pengetahuan & Media Bisnis Springer.
