penyangga fosfat, fosfat Buffered saline atau BPS merupakan penyangga isotonik, yang berfungsi untuk menjaga pH dan tekanan osmotik sebagai dekat dengan lingkungan biologis alami (fisiologis). Singkatan PBS adalah singkatan dari phosphate buffered saline.
PH dan osmolaritas adalah dua aspek yang sangat penting yang harus dikontrol dalam protokol laboratorium tertentu. Dalam hal pH, sangat penting untuk dikontrol, terutama dalam reaksi biokimia, karena ini dapat bervariasi atau tidak dilakukan jika reaktan berada pada pH yang tidak sesuai.
PBS fosfat buffered saline pada dua pH yang berbeda. Sumber: Pixinio.com
Sementara itu, kontrol osmolaritas sangat penting terutama ketika bekerja dengan sel hidup, karena membran plasma sel bereaksi sesuai dengan konsentrasi zat terlarut di mana mereka ditemukan.
Jika sel-sel dipindahkan ke media hipertonik mereka akan mengalami dehidrasi, karena gradien air akan diangkut ke sisi di mana terdapat konsentrasi zat terlarut yang lebih besar. Sebaliknya, jika sel-sel ditempatkan dalam media hipotonik, sel-sel akan menyerap cairan sampai mereka dilisiskan.
Itulah sebabnya buffer PBS digunakan untuk protokol laboratorium yang memerlukan pemeliharaan sel secara in vitro , dengan cara ini sel tidak akan rusak.
PBS terdiri dari kombinasi garam, seperti natrium klorida, natrium fosfat, kalium klorida, dan kalium fosfat. Komposisi PBS dapat bervariasi tergantung pada protokol.
Indeks artikel
Dasar
Pada dasarnya fungsi buffer fosfat adalah untuk mempertahankan pH fisiologis yang konstan bersama dengan konsentrasi elektrolit yang serupa dengan yang ditemukan di dalam tubuh.
Dalam lingkungan ini, sel dapat tetap stabil, karena kondisi fisiologis disimulasikan sebanyak mungkin.
Senyawa lain dapat ditambahkan pada formulasi PBS asli jika diperlukan, misalnya penambahan EDTA pada buffer berguna untuk mencuci sel darah merah pada uji inkompatibilitas silang.
EDTA mencegah fraksi komplemen C1 yang ada dalam serum agar tidak dipecah dan dilisiskan ke sel darah merah, yaitu, menghindari hasil ketidakcocokan yang salah. Selain itu, EDTA membantu memisahkan sel.
Persiapan
Jumlah garam yang harus ditimbang untuk persiapan fosfat PBS buffer saline akan tergantung pada kuantitas bahwa kebutuhan untuk menjadi siap:
– Larutan stok saline buffer fosfat (10X PBS)
Untuk satu liter larutan:
Menimbang:
80,6 g NaCl,
2,2 g KCl,
11,5 g Na 2 HPO 4 ,
2,0 g KH 2 HPO 4
Teknik persiapan
Dalam gelas kimia, tempatkan garam berat, tambahkan air secukupnya (80%) dan aduk di atas pelat pengaduk dengan batang magnet sampai garam larut.
Pembuatan PBS menggunakan plat pengaduk dengan batang magnet. Sumber: Pengguna: Ruhrfisch, Wikipedia. com
Filter untuk menghilangkan partikel yang tidak larut. Gunakan filter dengan pori-pori 0,45 m. Sterilkan dalam autoklaf dan distribusikan secara aseptik dalam tudung aliran laminar dalam stoples kaca dengan penutup.
Larutan 10X (konsentrat) tidak mengatur pH. Penyesuaian dilakukan setelah diencerkan dengan konsentrasi buffer 1X PBS, (1:10 pengenceran).
-Buffer fosfat saline (1X PBS)
1X PBS dapat dibuat secara langsung, dengan menimbang jumlah masing-masing garam yang sesuai, atau dapat dibuat dengan mengencerkan larutan stok (1:10) dengan air suling steril.
-Untuk menyiapkan langsung satu liter 1X PBS phosphate buffered saline, timbang:
8,06 g NaCl,
0,22 g KCl,
1,15 g Na 2 HPO 4 ,
0,20 g KH 2 HPO 4
Teknik persiapan
Lanjutkan seperti yang dijelaskan untuk larutan pekat. Selanjutnya, pH harus disesuaikan. Untuk melakukan ini, ukur pH dan tergantung pada hasilnya, gunakan asam (HCl) atau basa (NaOH) untuk menurunkan atau menaikkan pH masing-masing seperlunya, hingga mencapai 7,4.
Asam atau basa ditambahkan tetes demi tetes sambil memantau nilai pH larutan menggunakan pH meter. Saring, autoklaf, dan distribusikan secara aseptik ke dalam tabung atau stoples berbentuk kerucut sesuai kebutuhan.
-Untuk menyiapkan 1X PBS dari larutan stok 10X:
Buat pengenceran 1:10. Misalnya, untuk menyiapkan 1 liter 1X PBS, ukur 100 ml larutan stok dan tambahkan 700 ml air suling steril. Sesuaikan pH dan isi jumlah air hingga 1000 ml.
Buffer PBS yang disiapkan tidak berwarna dan jernih.
PBS untuk penggunaan sehari-hari dapat disimpan pada suhu kamar dan sisanya di lemari es.
Solusi untuk penyesuaian pH
HCl
Untuk 100 ml 1 molar HCL (asam klorida).
Ukur 91 mL air suling dan masukkan ke dalam gelas kimia 250 mL.
Ukur 8,62 mL HCl pekat dan tambahkan perlahan-lahan ke dalam gelas kimia yang berisi air (jangan lakukan sebaliknya). Ambil langkah-langkah keamanan hayati yang relevan saat menangani asam kuat (zat yang sangat korosif).
Campur selama 5 menit sebaiknya menggunakan pelat pengaduk dengan batang magnet di dalam gelas. Transfer ke labu ml 100 dan membuat hingga 100 ml dengan suling H 2 O.
NaOH
Untuk 100 ml NaOH (natrium hidroksida) 10 molar.
Ukur 40 mL air suling dan masukkan ke dalam gelas kimia 250 mL. Ukur 40 g NaOH dan tambahkan ke dalam air. Campur menggunakan pelat pengaduk dengan batang magnet di dalam gelas.
Pindahkan ke dalam labu takar 100 ml dan ditepatkan dengan air suling sampai tanda. Patuhi peraturan keamanan hayati, karena reaksi ini eksotermik (melepaskan energi dalam bentuk panas).
Jika Anda ingin menyiapkan larutan garam fosfat dalam jumlah lain, Anda dapat melihat tabel berikut:
Sumber: “Laboratorium Viral and Human Genomics, Fakultas Kedokteran UASLP”
Kegunaan
Ini terutama digunakan dalam biologi sel, imunologi, imunohistokimia, bakteriologi, virologi, dan laboratorium penelitian.
Ini sangat ideal untuk pencucian sel dengan sentrifugasi (sel darah merah), pencucian sel monolayer, dalam teknik elipsometri spektroskopi, dalam kuantifikasi biofilm bakteri, dalam pemeliharaan kultur sel untuk virus, sebagai larutan pencuci dalam teknik imunofluoresensi tidak langsung. dan dalam teknik untuk karakterisasi antibodi monoklonal.
Ini juga berfungsi untuk mengangkut sel atau jaringan, sebagai pengencer untuk penghitungan sel, persiapan enzim seluler (tripsin), sebagai pengencer untuk metode pengeringan biomolekul , dan untuk menyiapkan reagen lainnya.
Di sisi lain, Martin et al.Pada tahun 2006 menunjukkan bahwa PBS berguna di laboratorium ilmu forensik, khususnya dalam pemulihan sperma dari apusan vagina, atau dalam pemulihan sel-sel vagina dari apusan penis. Dengan cara ini dapat dipastikan jika telah terjadi hubungan seksual.
Keterbatasan
-Beberapa buffer PBS mengandung zat yang disebut natrium azida sebagai pengawet. Senyawa ini dapat menghasilkan bahan peledak jika bersentuhan dengan timbal atau tembaga. Untuk alasan ini, perhatian khusus harus diberikan saat membuang reagen ini ke saluran pembuangan. Jika dibuang dengan cara ini, air yang melimpah harus ditambahkan untuk mengencerkannya sebanyak mungkin.
– Seng tidak boleh ditambahkan ke buffer fosfat, karena menyebabkan beberapa garam mengendap.
-Wangen dan kolaborator pada tahun 2018 menetapkan bahwa penggunaan PBS tidak cocok untuk mencuci sel primer leukemia myeloid akut (AML) yang diekstraksi dari darah tepi, karena fakta bahwa banyak sel hilang karena lisis, dengan penurunan bahan yang besar protein.
Oleh karena itu, mereka menentukan bahwa sel AML primer tidak boleh dicuci dengan PBS setelah disimpan dalam nitrogen cair.
Referensi
- Kol J. (1993). Teknik diagnostik dalam virologi. Ed Diaz de Santos. 360 hal
- Rodríguez M, Ortiz T. Kultur sel. Perubahan Media. Departemen Sitologi dan Histologi Normal dan Patologis Universitas Seville. Tersedia di personal.us.es
- Pembuatan Phosphate Buffered Saline (PBS). (2008). Standar Operasional Prosedur (SOP) Laboratorium Genomik Manusia dan Virus Fakultas Kedokteran UASLP. Tersedia di: genomica.uaslp.mx
- “Saline Penyangga Fosfat.” Wikipedia, Ensiklopedia Bebas . 3 Apr 2019, 19:36 UTC. 13 Apr 2019, 02:57 en.wikipedia.org.
- Pietrasanta L, Von-Bilderling C. Topik dalam biofisika molekuler. Tersedia di: users.df.uba.ar
- Rediar. manual. PBS + EDTA. Tersedia di: felsan.com.ar
- Martin NC, Pirie AA, Ford LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG. Penggunaan saline buffer fosfat untuk pemulihan sel dan spermatozoa dari swab. Keadilan Sains. 2006; 46 (3): 179-84. Tersedia di: ncbi.nlm.nih.gov
- Wangen R, Aasebø E, Trentani A, dkk . Metode Pengawetan dan Pencucian Saline Buffer Fosfat Mempengaruhi Proteom Leukemia Myeloid Akut. Int J Mol Sci . 2018; 19 (1): 296. Tersedia di: ncbi.nlm.nih.gov
- Martínez R, Gragera R. (2008). Dasar teoritis dan praktis histokimia. Dewan Tinggi Investigasi Ilmiah. Madrid. Tersedia di: books.google.co.ve
