Mycobacterium tuberculosis divisualisasikan dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen
Apa itu pewarnaan Ziehl-Neelsen?
Ziehl-Neelsen teknik pewarnaan untuk mengidentifikasi mikroorganisme asam alkohol tahan (ARA). Nama prosedur mikrobiologi ini mengacu pada penulisnya: ahli bakteriologi Franz Ziehl dan ahli patologi Friedrich Neelsen.
Teknik ini adalah jenis pewarnaan diferensial, yang melibatkan penggunaan pewarnaan yang berbeda untuk menciptakan kontras antara struktur yang ingin Anda amati, diferensiasi, dan identifikasi nanti. Pewarnaan Ziehl-Neelsen digunakan untuk mengidentifikasi jenis mikroorganisme tertentu.
Beberapa organisme ini adalah mikobakteri (misalnya, Mycobacterium tuberculosis ), nocardia (misalnya, Nocardia sp.), Dan beberapa parasit bersel tunggal (misalnya, Cryptosporidium parvum ). Banyak bakteri dapat diklasifikasikan menggunakan teknik umum yang disebut pewarnaan Gram.
Namun, beberapa kelompok bakteri memerlukan metode lain untuk dapat mengidentifikasinya. Teknik seperti pewarnaan Ziehl-Neelsen membutuhkan kombinasi pewarna dengan panas untuk mengikat pewarna ke dinding sel.
Kemudian muncul proses perubahan warna yang memungkinkan diperoleh dua hasil: resistensi atau kepekaan terhadap perubahan warna oleh asam dan alkohol.
Dasar
Dasar pemikiran teknik pewarnaan ini didasarkan pada sifat-sifat dinding sel mikroorganisme tersebut. Dindingnya terdiri dari sejenis asam lemak yang disebut asam mikolat; Ini ditandai dengan memiliki rantai yang sangat panjang.
Ketika asam lemak memiliki struktur yang sangat panjang, mereka dapat menahan pewarna dengan lebih mudah. Beberapa genus bakteri sangat sulit untuk diwarnai dengan pewarnaan Gram, karena kandungan asam mikolat yang tinggi pada dinding selnya.
Pewarnaan Ziehl-Neelsen menggunakan senyawa fenolik karbol fuchsin, pewarna dasar. Ini memiliki kemampuan untuk berinteraksi dengan asam lemak dari dinding sel, yang bertekstur lilin pada suhu kamar.
Pewarnaan karbol fuchsin ditingkatkan dengan adanya panas, karena lilin meleleh dan molekul pewarna bergerak lebih cepat ke dalam dinding sel.
Asam yang digunakan kemudian berfungsi untuk menghitamkan sel-sel yang tidak diwarnai karena dindingnya tidak cukup berhubungan dengan pewarna; Oleh karena itu, kekuatan pemutih asam mampu menghilangkan pewarna asam. Sel yang menahan perubahan warna ini disebut tahan asam.
pewarna sekunder
Setelah dekolorisasi sampel, kontras dengan pewarna lain yang disebut pewarna sekunder. Umumnya, metilen biru atau hijau perunggu digunakan.
Pewarna sekunder menodai bahan latar belakang dan akibatnya menciptakan kontras dengan struktur yang diwarnai pada langkah pertama. Hanya sel yang berubah warna yang menyerap pewarna kedua (pewarnaan balik) dan mengambil warnanya, sedangkan sel tahan asam mempertahankan warna merahnya.
Prosedur ini sering digunakan untuk identifikasi Mycobacterium tuberculosis dan Mycobacterium leprae , yang disebut basil tahan asam.
Reagen
pewarna primer
0,3% karbol fuchsin (disaring) digunakan. Pewarna ini dibuat dari campuran alkohol: fenol dalam etanol (90%) atau metanol (95%), dan 3 gram fuchsin dasar dilarutkan dalam campuran ini.
Solusi pemutihan
Pada langkah ini, larutan asam alkohol 3% atau asam sulfat 25% dapat digunakan.
Pewarna sekunder (pewarna tandingan)
Pewarna yang paling sering digunakan untuk membedakan sampel biasanya 0,3% biru metilen. Namun, yang lain juga dapat digunakan, seperti 0,5% malachite green.
Teknik
Nematoda divisualisasikan dengan Ziehl-Neelsen
Prosedur pewarnaan tahan asam
Siapkan apusan bakteri
Persiapan ini dilakukan pada slide yang bersih dan kering, mengikuti tindakan pencegahan sterilitas.
Pengeringan noda
Biarkan apusan mengering pada suhu kamar.
Panaskan sampel
Sampel harus dipanaskan dengan menerapkan api ke slide di bawah ini. Fiksasi alkohol dapat dilakukan bila apusan belum dipreparasi dengan sputum (diobati dengan natrium hipoklorit untuk memutihkannya) dan jika tidak akan segera ternoda.
M. tuberculosis dihilangkan dengan pemutih dan selama proses pewarnaan. Fiksasi panas sputum yang tidak diobati tidak akan membunuh M. tuberculosis , sedangkan fiksasi alkohol bersifat bakterisida.
Tutupi noda
Noda ditutup dengan larutan karbol fuchsin (pewarna dasar primer).
Panaskan noda
Ini dilakukan selama 5 menit. Anda akan melihat evolusi uap (sekitar 60 ° C). Penting untuk tidak terlalu panas dan menghindari pembakaran sampel.
Berkenaan dengan pemanasan noda, harus sangat berhati-hati saat memanaskan karbol fuchsin, terutama jika pewarnaan dilakukan pada nampan atau wadah lain di mana bahan kimia yang sangat mudah terbakar dari pewarnaan sebelumnya telah dikumpulkan.
Hanya nyala api kecil yang harus diterapkan di bawah slide menggunakan swab yang telah dinyalakan sebelumnya yang dibasahi dengan beberapa tetes alkohol asam, metanol, atau etanol 70%. Hindari menggunakan swab besar yang direndam dalam etanol karena dapat menimbulkan bahaya kebakaran.
Cuci noda
Pencucian ini harus dilakukan dengan air bersih. Jika air keran tidak bersih, cuci noda dengan air yang disaring atau disuling, lebih disukai.
Tutup apusan dengan alkohol asam
Alkohol asam ini harus pada 3%. Penutupan dilakukan selama 5 menit atau sampai apusan cukup berubah warna yaitu berwarna merah muda pucat.
Harus diperhitungkan bahwa alkohol asam mudah terbakar; oleh karena itu, harus digunakan dengan sangat hati-hati. Hindari berada di dekat sumber api.
Cuci noda
Mencuci harus dengan air suling yang bersih.
Tutupi noda dengan noda
Dapat berupa noda malachite green (0,5%) atau methylene blue (0,3%) selama 1 atau 2 menit, menggunakan waktu yang lebih lama jika apusannya tipis.
Cuci noda
Sekali lagi air bersih (suling) harus digunakan.
untuk menguras
Bagian belakang slide harus dibersihkan dan noda ditempatkan pada rak pembuangan agar kering (jangan gunakan kertas penyerap untuk mengeringkan).
Periksa apusan di bawah mikroskop
Minyak objektif dan minyak imersi 100X harus digunakan. Pindai apusan secara sistematis dan catat pengamatan terkait.
Interpretasikan hasilnya
Secara teoritis, mikroorganisme yang menodai warna kemerahan dianggap positif tahan asam (AAR+).
Sebaliknya, jika mikroorganisme bernoda biru atau hijau, tergantung pada pewarna yang digunakan sebagai pewarna tandingan, mereka dianggap negatif tahan asam (AAR-).
Referensi
- Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Esensi Mikrobiologi Praktis (edisi ke-1). Penerbit Medis Jaypee Brothers.
- Bauman, R. (2014). Mikrobiologi dengan Penyakit menurut Sistem Tubuh (edisi ke-4). Pendidikan Pearson, Inc.
- Warisan, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Mikrobiologi Pengantar (edisi ke-1). Pers Universitas Cambridge.
- Morello, J., Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). Manual Laboratorium dan Buku Kerja dalam Mikrobiologi: Kegunaan untuk Perawatan Pasien (Edisi ke-11). Pendidikan McGraw-Hill.
- Vasanthakumari, R. (2007). Buku Ajar Mikrobiologi (Edisi ke-1). PVT Publikasi BI.