Uji oksidase: alasan, prosedur, dan kegunaan

Uji oksidase adalah metode diagnostik yang menunjukkan adanya kompleks enzim yang disebut sitokrom oksidase c. Sistem ini menginduksi transformasi sitokrom tereduksi menjadi teroksidasi, karena ia menangkap oksigen dan pada gilirannya bertindak sebagai akseptor elektron terakhir (H + ) dalam rantai pernapasan.

Istilah oksidase adalah cara singkat untuk merujuk pada enzim sitokrom oksidase, juga dikenal sebagai indofenol oksidase. Pada zaman dahulu diyakini bahwa enzim sitokrom oksidase dan indofenol oksidase adalah dua enzim yang berbeda, tetapi hari ini keduanya diketahui sama.

Uji oksidase

Tes oksidase positif dan negatif. Sumber: Tidak ada penulis yang dapat dibaca mesin yang disediakan. Alpha.prim ~ commonswiki diasumsikan (berdasarkan klaim hak cipta). [Area publik]

Untuk bagian mereka, sitokrom adalah hemoprotein yang mengandung zat besi dan melengkapi sistem sitokrom oksidase. Sitokrom dapat bervariasi dari satu spesies ke spesies lainnya.

Ada berbagai jenis sitokrom (sitokrom a1, a2, a3 dan 0). Beberapa bakteri hanya dapat menghasilkan satu, tetapi yang lain hingga dua atau tiga sekaligus. Dalam pengertian ini, kehadiran sitokrom a dan a3 dikenal sebagai sitokrom oksidase c. Ini adalah jenis sitokrom yang dideteksi oleh tes oksidase.

genera Neisseria dan Pseudomonas mengandung sitokrom oksidase c. Genera ini memberikan tes oksidase positif, membantu membedakan mereka dari genera Acinetobacter dan Stenotrophomonas masing-masing.

Ada juga genera lain yang positif oksidase.

Indeks artikel

Dasar

Karakteristik sistem sitokrom oksidase c

Sistem sitokrom oksidase c bekerja dengan cara berikut: mikroorganisme positif oksidase menggunakan oksigen untuk menghasilkan energi melalui respirasi aerobik . Sistem ini bekerja berkat transpor elektron dari zat donor seperti NADH + ke zat reseptor, dalam hal ini oksigen.

Hal ini menghasilkan produksi energi ( ATP ) dan air atau hidrogen peroksida, tergantung pada sistem sitokrom oksidase yang dimiliki mikroorganisme.

Itulah sebabnya sebagian besar bakteri positif oksidase juga katalase positif, suatu kondisi yang diperlukan untuk menghilangkan hidrogen peroksida yang dihasilkan, karena zat ini beracun bagi bakteri.

Sistem sitokrom oksidase c terdapat pada beberapa bakteri aerob, beberapa anaerob fakultatif, beberapa mikroaerofilik, dan tidak ada anaerob ketat. Yang terakhir dapat dimengerti, karena anaerob yang ketat tidak dapat hidup dengan adanya oksigen, oleh karena itu mereka tidak memiliki sistem sitokrom oksidase.

Prinsip pengujian

Dalam tes ini menggunakan zat yang bertindak sebagai akseptor elektron buatan, menggantikan yang alami dalam rantai transpor elektron.

Terutama, pewarna seperti paraphenylenediamine dan indophenol digunakan, yang bertindak sebagai substrat reseptor dan donor elektron buatan.

Paraphenylenediamine dioksidasi oleh sistem sitokrom oksidase c. Pewarna dalam bentuk tereduksinya tidak berwarna, tetapi dalam bentuk teroksidasinya berwarna.

Ini adalah bagaimana keberadaan sistem sitokrom oksidase c dibuktikan; karena reaksi positif akan menghasilkan warna lavender atau biru-ungu tergantung pada reagen yang digunakan.

Di sisi lain, jika zat penerima elektron terakhir dalam rantai pernapasan berbeda dari oksigen, uji oksidase akan negatif (tidak ada produksi warna); ini adalah kasus dengan mikroorganisme anaerobik.

Demikian pula, jika sitokrom yang digunakan mikroorganisme berbeda dengan sitokrom oksidase c, juga akan memberikan tes negatif.

Proses

Ada berbagai reagen dan protokol untuk uji oksidase, semuanya untuk tujuan yang sama.

Reagen

Reagen Kovacs, reagen Gordon dan McLeod, reagen Nadi, Carpenter, reagen Suhrland dan Morrison, dan penggunaan cakram oksidase.

-Reagen Kovacs oksidase

Ini terdiri dari 1% tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride.

Reagen Kovacs dibuat dengan melarutkan 1 g zat yang disebutkan di atas dalam 50 ml air suling. Hal ini dipanaskan halus sampai benar-benar larut. Transfer ke botol kuning dari kapasitas yang cukup dan membentuk volume yang ke 100 ml dengan air suling. Tunggu setidaknya 15 menit sebelum digunakan. Simpan dalam lemari es terlindung dari cahaya.

Ini diberi label reagen Kovacs oksidase, untuk membedakannya dari reagen Kovacs yang digunakan untuk mengungkapkan uji indol. Reagen ini adalah yang paling sensitif, kurang beracun tetapi lebih mahal daripada reagen lainnya.

Reaksi positif akan dibuktikan dengan reagen ini dengan perubahan warna koloni menjadi lavender, yang dengan cepat berubah menjadi ungu hampir hitam. Reaksi negatif dibuktikan karena tidak ada perubahan warna pada koloni atau terjadi sedikit warna merah muda. Media juga bisa menjadi gelap, tetapi itu tidak berarti reaksi positif.

Dengan reagen ini, waktu reaksi sangat menentukan, perubahan warna yang terjadi antara 5 hingga 15 detik dianggap sebagai reaksi positif.

-Pereaksi Gordon dan McLeod

Ini terdiri dari dimetil-p-fenilendiamina dihidroklorida, juga dikenal sebagai N-dimetil-p-fenilendiamin atau p-aminodimetilanilin monohidroklorida. Ini dibuat seperti yang dijelaskan untuk reagen Kovacs oksidase, menggantikan zat yang terlibat.

Reagen ini sedikit lebih stabil daripada reagen Kovacs oksidase, meskipun semua reagen yang mengandung p-phenylenediamine tidak stabil.

Reaksi ini kemudian ditafsirkan sebagai positif dengan munculnya warna biru-ungu dalam waktu 10 sampai 30 menit.

-reagen Nadi

Ini terdiri dari 1% -naftol dalam etil alkohol (95% etanol) dan 1% aminodimethylaniline. Campuran dibuat dalam bagian yang sama dan menggunakan etil alkohol absolut sebagai pengencer, sampai mencapai jumlah yang cukup untuk 100 ml.

-Pereaksi Carpenter, Suhrland dan Morrison

Ini terdiri dari 1% p-aminodimethylalanine oksalat. Siapkan dengan cara yang sama seperti yang dijelaskan untuk reagen Kovacs oksidase, ganti untuk zat yang sesuai.

Dengan larutan siap, strip uji disiapkan sebagai berikut: 6-8 cm Strip kertas saring Whatman No. 1 diresapi dengan reagen dimetil-p-fenilendiamin oksalat 1%.

Mereka dibiarkan kering tanpa kontak dengan logam, simpan dalam stoples berpenutup ulir dengan pengering dan simpan di lemari es. Strip ini stabil hingga 6 bulan.

Ini adalah reagen paling stabil dari semua yang disebutkan, mampu bertahan hingga 6 bulan dalam larutan. Poin plus lainnya adalah tidak mewarnai media di sekitar koloni, jika digunakan langsung di piring.

Munculnya warna merah ditafsirkan sebagai tes positif.

-Cakram oksidase

Mereka adalah cakram komersial yang diresapi dengan reagen untuk uji oksidase. Ada berbagai merek dagang di pasar.

Penggunaannya cukup praktis, karena tidak perlu menyiapkan reagen segar, yang memudahkan pekerjaan. Hasil yang diperoleh dapat diandalkan selama disk disimpan dengan benar.

Protokol

Metode pelat langsung, metode tidak langsung di atas kertas dan penggunaan cakram yang diresapi dengan reagen oksidase.

-Metode papan langsung

2 atau 3 tetes dari salah satu reagen yang disebutkan di atas ditambahkan untuk tujuan ini secara langsung pada koloni yang terkandung dalam cawan media kultur yang tidak mengandung glukosa.

Perubahan warna koloni yang diinterpretasikan, bukan medianya. Waktu reaksi yang valid tergantung pada reagen yang digunakan.

-Metode tidak langsung di atas kertas

Potong selembar kertas saring (Whatman No. 1) dengan ukuran 6 cm 2 dan letakkan di dalam cawan Petri kosong.

Tambahkan 2 atau 3 tetes reagen Kovacs oksidase di atas kertas, ambil bagian koloni yang akan dipelajari dengan gagang platina atau tusuk gigi kayu dan olesi dengan garis lurus di atas kertas yang diresapi reagen. Lakukan dalam 5 hingga 10 detik.

Dengan strip yang disiapkan dengan reagen Carpenter, Suhrland dan Morrison, sebuah koloni disebarkan pada strip kering. Sebuah strip tunggal digunakan untuk menguji beberapa strain. Interpretasikan dalam 10 detik.

-Disk (metode langsung)

Basahi cakram komersial secara halus dengan air suling steril dan tempelkan pada koloni yang akan dipelajari. Disarankan untuk menggunakan pelat pada suhu 35 ° C, jika pelat pada suhu kamar atau pelat berpendingin digunakan, reaksinya sedikit lebih lambat. Menafsirkan perubahan warna antara 10 hingga 20 detik.

Koloni yang terdapat pada agar darah atau agar coklat dapat digunakan.

-Disk (metode tidak langsung)

Basahi disk seperti yang dijelaskan sebelumnya. Letakkan dalam cawan petri kosong. Ambil koloni dalam jumlah yang cukup untuk dipelajari dengan gagang platina atau tusuk gigi kayu dan letakkan pada piringan. Menafsirkan perubahan warna antara 10 hingga 20 detik.

Menggunakan

Genus Neisseria dan Acinetobacter kadang-kadang sangat mirip secara morfologi karena meskipun genus Acinetobacter adalah batang Gram negatif, kadang-kadang dapat mengambil bentuk coccoid dan didistribusikan berpasangan, mensimulasikan genus Neisseria.

Dalam hal ini uji oksidase sangat berguna. Genus Neisseria positif dan Acinetobacter negatif.

Namun, genus Moraxella sangat mirip dengan genus Neisseria dan keduanya memberikan reaksi positif; Untuk itu , uji fermentasi karbohidrat harus selalu dilakukan untuk identifikasi definitif.

Di sisi lain, uji oksidase berguna untuk membedakan bakteri yang termasuk dalam famili Enterobacteriaceae (semua oksidase negatif) dari fermentor lain, seperti genus Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oksidase positif).

Genus Vibrio dan Helicobacter juga positif oksidase.

QA

Gunakan galur Escherichia coli yang diketahui sebagai kontrol negatif dan galur Pseudomonas aeruginosa sebagai kontrol positif.

Keterbatasan

– Reagen harus digunakan dalam keadaan segar, masa pakainya dalam larutan pada suhu kamar pendek karena sangat tidak stabil. Dikulkas mereka bisa bertahan antara 5 hari sampai 2 minggu.

– Reagen tidak berwarna, jika berubah warna harus dibuang. Disk yang rusak terlihat jelas karena menjadi gelap seiring waktu.

-Reaksi positif dengan reagen Kovacs oksidase antara 15-60 detik dianggap sebagai reaksi tertunda dan setelah 60 detik harus dianggap negatif.

-Haemophilus influenzae memberikan reaksi oksidase negatif jika ada reagen digunakan dengan dimetil-p-phenylenediamine, tapi positif jika Kovacs oksidase reagen (tetramethyl-p-phenylenediamine) digunakan.

-Media yang mengandung glukosa mengganggu tes, memberikan negatif palsu.

Pertusis -Bordetella strain dapat memberikan reaksi positif palsu jika mereka datang dari darah yang sangat terkonsentrasi agar piring.

-Penggunaan pegangan logam (besi) memberikan reaksi positif palsu.

rekomendasi

-Karena reagen sangat tidak stabil dan cenderung mengoksidasi sendiri, disarankan untuk membekukan alikuot 1 hingga 2 ml dan membuangnya sesuai kebutuhan.

-Cara lain untuk menunda auto-oksidasi reagen adalah dengan menambahkan 0,1% asam askorbat saat menyiapkan reagen.

-Karena reagen tidak stabil, direkomendasikan untuk melakukan kontrol kualitas mingguan.

-Reagen yang tidak lulus uji kendali mutu tidak boleh digunakan.

Referensi

  1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosa Mikrobiologi. edisi ke-5. Editorial Panamericana SA Argentina.
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnosa Mikrobiologi Bailey & Scott. 12 edisi Editorial Panamericana SA Argentina.
  3. “Uji Oksidase.” Wikipedia, Ensiklopedia Bebas . 15 Januari 2018, 10:32 UTC. 3 April 2019, 14:03 <https://es.wikipedia.org/.
  4. Organisasi Kesehatan Dunia. Manual Laboratorium untuk Identifikasi dan Pengujian Kerentanan Antimikroba Bakteri Patogen Pentingnya Kesehatan Masyarakat di Negara Berkembang 2004. Tersedia di: who.int/drugresistance/infosharing
  5. Strip reagen untuk diagnosis aktivitas oksidase pada bakteri. Rev Cubana Med Trop [Internet]. 2000; 52 (2): 150-151.