Uji katalase adalah metodologi yang digunakan di laboratorium bakteriologi untuk menunjukkan adanya enzim katalase pada bakteri yang memilikinya. Bersama dengan pewarnaan Gram, ini adalah tes utama yang harus dilakukan pada mikroorganisme yang baru diisolasi. Tes-tes ini memandu ahli mikrobiologi pada langkah-langkah yang harus diikuti untuk identifikasi definitif mikroorganisme yang bersangkutan.
Secara umum, bakteri yang mengandung sitokrom memiliki enzim katalase, yaitu bakteri aerob dan anaerob fakultatif yang memilikinya. Namun, ada pengecualian, seperti Streptococcus, yang meskipun mikroorganisme anaerob fakultatif tidak memiliki enzim katalase.
Menjalankan Tes Katalase, menunjukkan reaksi positif. Sumber: Tidak ada penulis yang dapat dibaca mesin yang disediakan. Nase diasumsikan (berdasarkan klaim hak cipta). [CC BY-SA 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/)]
Inilah sebabnya mengapa uji katalase digunakan terutama untuk membedakan famili Staphylococaceae dan Micrococaceae (keduanya katalase positif) dari famili Streptococaceae (katalase negatif).
Demikian pula, genus Bacillus (katalase positif) dibedakan dari genus Clostridium (katalase negatif), antara lain.
Indeks artikel
Dasar
Katalase adalah enzim yang tergolong hidroperoksidase, artinya mereka menggunakan hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) sebagai substrat .
Ini juga dianggap sebagai oksidoreduktase, karena dalam reaksi di mana ia berpartisipasi ada unsur yang berfungsi sebagai donor elektron (zat pereduksi) dan yang lain sebagai reseptor elektron (zat pengoksidasi).
Katalase adalah protein yang mengandung gugus proserik dengan empat atom besi trivalen (Fe +++ ), oleh karena itu merupakan homoprotein. Ion besi tetap teroksidasi selama reaksi.
Dapat dikatakan bahwa katalase adalah enzim detoksifikasi, karena fungsinya untuk menghilangkan zat-zat yang dihasilkan selama metabolisme bakteri yang bersifat racun bagi bakteri. Di antara zat tersebut adalah hidrogen peroksida.
Hidrogen peroksida terbentuk dari pemecahan gula secara aerobik. Proses ini terjadi sebagai berikut:
Ion superoksida (O 2 – ) (radikal bebas) terbentuk sebagai produk akhir dari asimilasi glukosa melalui rute aerobik. Ini beracun dan dihilangkan oleh enzim superoksida dismutase yang mengubahnya menjadi oksigen gas dan hidrogen peroksida.
Hidrogen peroksida juga beracun bagi bakteri dan harus dihilangkan. Enzim katalase memecah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen.
Katalase dapat bekerja pada substrat selain hidrogen peroksida, seperti alkohol, aldehida, asam, amina aromatik, dan fenol. Namun, hidrogen peroksida juga dapat digunakan oleh katalase untuk mengoksidasi senyawa beracun lainnya seperti metil dan etil alkohol.
Demikian juga, katalase hadir dalam sel fagosit, melindunginya dari aksi toksik hidrogen peroksida.
Teknik Rutin Tes Katalase
-Metode geser
bahan
3% hidrogen peroksida (10 volume).
Geser mikroskop
Pegangan plastik sekali pakai atau tusuk gigi kayu.
Proses
Ambil cukup banyak koloni untuk dipelajari tanpa menyentuh agar-agar dari mana ia berasal. Koloni harus segar, yaitu dari kultur 18 hingga 24 jam.
Tempatkan koloni pada slide kering dan tambahkan setetes hidrogen peroksida 3% ( 30% H 2 O 2 juga dapat digunakan ). Amati segera apakah gelembung keluar atau tidak.
Penafsiran
Reaksi positif: evolusi gas, dibuktikan dengan terbentuknya gelembung (bubbling kuat).
Reaksi negatif: tidak ada pembentukan gelembung.
-Metode langsung dalam kultur murni
Tempat 1 ml 3% H 2 O 2 di piring murni atau budaya wedge yang tidak mengandung darah (agar lebih nutrisi). Amati segera ada atau tidaknya pembentukan gelembung. Anda juga dapat menggunakan 30% H 2 O 2 .
Ini ditafsirkan sama dengan metode objek porta.
-Metode dengan pipa kapiler atau Fung dan Petrishko
Isi tabung kapiler 67 mm hingga ketinggian 20 mm dengan hidrogen peroksida 3% secara kapilaritas.
Sentuh koloni terisolasi dipelajari dengan kapiler diisi dengan 3% H 2 O 2 . Amati apakah kapiler terisi gelembung dalam waktu sekitar 10 detik. Metode ini memungkinkan semi-kuantifikasi reaksi dalam persilangan:
Tanpa salib tidak ada gelembung (reaksi negatif).
+ ———- Beberapa gelembung (reaksi lemah atau tertunda).
++ ——– Gelembung berlimpah (reaksi sedang).
+++ ——Gelembung mencapai ekstrem yang berlawanan (reaksi yang kuat).
-Metode Taylor dan Achanzar untuk tes katalase yang meragukan
Tempatkan koloni terisolasi pada kaca objek yang bersih dan kering, kemudian teteskan 0,5% H 2 O 2 dan tutup dengan kaca penutup. Amati ada tidaknya pembentukan gelembung-gelembung yang terperangkap.
Interpretasi: adanya gelembung menunjukkan reaksi positif. Tidak ada gelembung, itu ditafsirkan sebagai reaksi negatif.
Uji katalase untuk spesies Mycobacterium
Teknik ini perlu dilakukan dengan mengontrol pH dan suhu. Itu harus dilakukan di bawah tudung aliran laminar, karena manipulasi spesies Mycobacterium yang berbeda berbahaya.
-Bahan
Hidrogen peroksida 30% atau 110 volume (superoksal).
Buffer fosfat pH 7
10% Tween 80
Kultur Wedge Mycobacterium selama 3 hingga 4 minggu
-Persiapan reagen
Buffer fosfat pH 7
Menimbang:
1,361 g monopotassium fosfat anhidrat (KH 2 PO 4 ).
1,420 g dinatrium anhidrat (Na2HPO3) fosfat.
Larutkan kedua garam dalam sedikit air suling steril dan buat hingga 1000 ml dengan air.
10% Tween 80
Buat pengenceran 1:10 ke Tween 80 yang dipekatkan secara komersial, untuk melakukan ini, lakukan sebagai berikut:
Ambil 1 ml Tween 80 dan masukkan ke dalam sedikit air suling, larutkan lalu dicukupkan volumenya dengan air hingga 10 ml.
Reagen akhir
Campurkan sejumlah buffer fosfat dengan jumlah 10% Tween 80 (dalam bagian yang sama). Tentukan di laboratorium berapa banyak yang ingin Anda siapkan.
-Proses
Tempatkan 5 ml buffer fosfat dalam tabung reaksi tertutup ulir steril (Bakelite).
Dengan loop inokulasi, ambil cukup banyak koloni pertumbuhan Mycobacterium yang diunggulkan dalam irisan dan larutkan dalam buffer fosfat.
Tutup tabung tanpa terlalu mengencangkan benang. Tempatkan dalam penangas air pada 68 ° C selama 20 hingga 30 menit. Keluarkan dan dinginkan hingga 22-25 ° C
Ukur 0,5 ml reagen akhir (campuran) dan tambahkan ke tabung dengan larutan dingin. Amati terbentuknya gelembung atau tidak.
Ini ditafsirkan sama dengan teknik sebelumnya.
Menggunakan
Ketika pertumbuhan koloni diperoleh dalam media yang diperkaya, pewarnaan Gram dan uji katalase harus dilakukan pada koloni yang diperoleh. Ini akan memandu ahli mikrobiologi tentang prosedur yang harus diikuti untuk identifikasi definitif.
Sumber: Disiapkan oleh penulis MSc. Marielsa Gil
QA
Untuk mengevaluasi kinerja yang baik dari reagen hidrogen peroksida, gunakan strain kontrol yang baru dikultur, seperti Staphylococcus aureus sebagai kontrol positif dan strain Streptococcus sp sebagai kontrol negatif.
Alternatif lain yang berfungsi sebagai kontrol positif adalah dengan menempatkan setetes hidrogen peroksida pada agar darah, eritrosit memiliki katalase, sehingga akan terjadi gelembung jika reagen dalam kondisi baik.
Agar coklat dapat digunakan sebagai kontrol negatif, di sini eritrosit sudah dilisiskan dan tesnya negatif.
Keterbatasan
-Jangan gunakan kultur lama untuk tes, karena ini dapat menyebabkan negatif palsu.
-Hindari pengambilan koloni dari biakan pada agar darah, jika berhati-hati untuk tidak menyentuh agar; Prosedur ini dapat menyebabkan hasil positif palsu, karena sel darah merah mengandung katalase.
-Jika Anda mengambil koloni dengan pegangan platina, jangan membalik urutan prosedur karena ini dapat menghasilkan positif palsu. Ini karena platinum mampu bereaksi dengan hidrogen peroksida, menyebabkan gelembung.
-Jangan gunakan reagen hidrogen peroksida jika sudah sangat tua, karena reagen sangat tidak stabil dan cenderung rusak seiring waktu.
-Jaga reagen hidrogen peroksida terlindung dari cahaya dan didinginkan untuk menghindari kerusakan.
-Lakukan kontrol kualitas reagen hidrogen peroksida setiap kali digunakan.
-Perhatikan bahwa jika 30% H 2 O 2 digunakan, reaksi lebih kuat daripada yang dilakukan dengan 3% H 2 O 2 .
Referensi
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosa Mikrobiologi. edisi ke-5. Editorial Panamericana SA Argentina.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnosa Mikrobiologi Bailey & Scott. 12 edisi Editorial Panamericana SA Argentina.
- Mac Faddin J. (2003). Tes biokimia untuk identifikasi bakteri yang penting secara klinis. edisi ke-3 Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
- Laboratorium BD. Reagen Katalase-Gotario. Tersedia di: http://winklerltda.cl
- Laboratorium Vadequimica. Peroksida. Kesetaraan antara volume dan persentase. Tersedia di: vadequimica.com
