Pengurutan DNA: Maxam-Gilbert, metode dan contoh

urutan DNA (asam deoksiribonukleat) adalah prosedur di laboratorium biologi molekuler yang memungkinkan untuk mengetahui urutan nukleotida dalam materi genetik yang menarik. Selanjutnya, sekuensing RNA (asam ribonukleat) juga dapat diungkapkan.

Teknik ini sangat diperlukan untuk pengembangan ilmu biologi. Ini juga berlaku untuk bidang pengetahuan lain – seperti diagnosis medis dan investigasi forensik, misalnya.

Sumber: pixabay.com

Sebelumnya, pengurutan untai DNA dianggap sebagai aktivitas yang lambat dan mahal, yang memungkinkan identifikasi hanya beberapa pasangan basa dalam oligonukleotida.

Saat ini, dengan semua kemajuan ilmu pengetahuan, pengurutan DNA adalah operasi rutin di banyak laboratorium di seluruh dunia berkat kontribusi hampir 50 tahun penelitian di bidang ini. Dalam hal panjang rantai, hingga jutaan pasangan basa dapat diurutkan dalam waktu yang sangat singkat.

Untuk melakukan ini, ada lusinan teknik yang dikembangkan dengan harga dan presisi yang bervariasi. Pada artikel ini, kita akan menjelaskan teknik klasik dan cararn, masing-masing dengan kelebihan dan kekurangannya.

Sampai saat ini, teknik sekuensing memungkinkan untuk mendapatkan urutan genom lengkap, dari prokariota kecil dan ragi hingga genom manusia.

Indeks artikel

struktur DNA

Untuk memahami metode dan teknik yang digunakan untuk pengurutan DNA, perlu diketahui aspek-aspek kunci tertentu dari struktur dan komposisi molekul.

DNA adalah biomolekul yang ditemukan di semua makhluk hidup, dari bakteri hingga hewan air besar . Organel – seperti mitokondria dan kloroplas – memiliki molekul DNA melingkar di dalamnya. Bahkan pada beberapa virus, materi genetik yang ditemukan adalah DNA.

Secara struktural, DNA adalah kumpulan nukleotida. Masing-masing terdiri dari karbohidrat, basa nitrogen (A, T, C atau G) dan gugus fosfat. Tujuan dari sekuensing DNA adalah untuk mengungkapkan urutan di mana empat basa nitrogen ditemukan dalam urutan.

Sejarah

Pada pertengahan 1950-an, peneliti Watson dan Crick menggambarkan struktur DNA menggunakan teknik kristolografi. Namun, tidak satu pun dari para peneliti ini yang dapat menemukan cara untuk mengungkap urutannya.

Meskipun ada pendahulu tertentu, peristiwa yang paling penting adalah penciptaan metode Sanger, pada tahun 1977. Frederick Sanger, bapak metode ini, adalah seorang ahli biokimia Inggris, pemenang dua hadiah Nobel untuk kontribusinya yang besar pada ilmu biologi.

Teknik ini juga dikenal dalam literatur sebagai “penghentian rantai” atau dideoksinukleotida. Prinsip-prinsip teknik ini dan yang dikembangkan berdasarkan perbaikan dan inovasi akan dijelaskan di bawah ini.

Metode Sanger

Perkembangan metode Sanger mewakili peristiwa penting dalam biologi molekuler. Ini melibatkan komponen dasar dari proses replikasi DNA yang biasanya terjadi di dalam sel, tetapi menambahkan komponen khusus: dideoksinukleotida.

Komponen utama reaksi

– DNA polimerase: enzim DNA polimerase merupakan unsur penting dari proses. Molekul ini berpartisipasi dalam replikasi untai DNA dan perannya adalah sintesis untai baru, memasangkan deoksiribonukleotida trifosfat dengan yang komplementer.

Ingatlah bahwa dalam DNA, timin (T) berpasangan dengan adenin (A) melalui dua ikatan hidrogen, sedangkan sitosin (C) melakukannya dengan guanin (G) melalui tiga jembatan.

– Nukleotida: Pengurutan Sanger melibatkan dua jenis nukleotida, empat 2′-deoksinukleotida (disingkat dATP, dGTP, dCTP dan dTTP) dan empat dideoksinukleotida khusus (ddATP, ddGTP, ddCTP dan ddTTP).

Meskipun dideoksinukleotida mirip dengan monomer yang biasanya dimasukkan ke dalam DNA, mereka tidak memiliki gugus -OH dalam strukturnya. Hal ini membuat tidak mungkin untuk menambahkan nukleotida baru ke rantai.

Oleh karena itu, ketika nukleotida khusus ditambahkan – dengan cara yang benar-benar acak – ke rantai dalam pembentukan, sintesis menjadi lumpuh. Dengan cara ini, pada akhir reaksi, ada rantai dengan ukuran berbeda, masing-masing di mana reaksi dihentikan pada titik yang berbeda.

Secara eksperimental, empat tes disiapkan. Masing-masing berisi DNA yang diekstraksi dari sampel biologis yang diinginkan, nukleotida normal, dan salah satu dari empat jenis nukleotida khusus. Atau nukleotida khusus ditandai dengan beberapa jenis penanda fluoresen (lihat pengurutan otomatis di bawah).

Membaca hasil

Langkah pertama adalah memisahkan masing-masing rantai yang disintesis menurut ukurannya. Beberapa akan lebih panjang dari yang lain, tergantung di mana pangkalan khusus didirikan.

Ada berbagai teknik biokimia yang memungkinkan pemisahan komponen campuran menggunakan ukuran sebagai sifat diskriminatif. Dalam metode Sanger, rantai yang berbeda dipisahkan dengan elektroforesis. Dalam varian teknik yang lebih canggih, elektroforesis kapiler digunakan.

Jadi, untaian yang lebih panjang berjalan lebih sedikit daripada varian yang lebih pendek. Sistem ini kemudian melewati pembaca yang mengenali penanda yang disertakan dalam setiap dideoksinukleotida. Dengan cara ini, urutan urutan dapat diketahui.

Teknik “generasi pertama” ini mampu membaca fragmen DNA tidak lebih besar dari 1 kilobase. Saat ini, metode Sanger digunakan di berbagai laboratorium, umumnya dalam varian cararn. Selain itu, digunakan untuk menguatkan hasil yang diperoleh dengan teknik yang paling kompleks – tetapi kurang tepat.

Pengurutan otomatis

Ketika pengurutan diperlukan dalam skala besar, prosesnya dipercepat melalui otomatisasi. Ini adalah variasi dari metode pemutusan rantai Sanger, di mana primer diberi label dengan produk fluoresen untuk membedakannya.

Selanjutnya, produk reaksi dijalankan dalam elektroforesis – semua dalam satu jalur. Setiap fragmen keluar dari bagian akhir gel, dengan cepat diidentifikasi dengan pelabelan fluoresennya, dengan kesalahan sekitar 1%.

Sistem yang paling canggih memiliki sistem hingga 96 tabung kapiler yang dikelola oleh komputer yang digabungkan dengan robot. Artinya, 96 sampel DNA bisa diuji secara bersamaan. Dengan demikian, proses yang melibatkan elektroforesis dan analisis hasil sepenuhnya otomatis.

Dalam satu hari, sistem ini dapat mengurutkan hingga 550.000 basis. Selama proses, tenaga manusia tidak diperlukan, hanya membutuhkan waktu sekitar 15 menit untuk memulai metode.

Urutan Maxam-Gilbert

Pada saat Sanger menerbitkan karyanya, dua peneliti bernama Allan Maxan dan Walter Gilbert berhasil mengembangkan metode lain untuk mendapatkan urutan DNA. Metode ini mendapatkan popularitas pada saat itu, tetapi kemudian digantikan oleh peningkatan metode Sanger.

Berlawanan dengan metode Sanger, sekuensing Maxan dan Gilbert (atau sekuensing kimia, seperti yang juga dikenal) tidak melibatkan reaksi hibridisasi. Metodologi terdiri dari pelabelan dengan agen reaktif di salah satu ujungnya, diikuti dengan proses pemurnian.

Salah satu aspek negatif dari teknik ini terletak pada kerumitannya yang sangat besar dan penggunaan bahan kimia yang berbahaya bagi pengguna. Kerusakan kimia disebabkan oleh penerapan DMS, asam format, hidrazin, dan hidrazin dengan garam.

Proses

Protokol dimulai dengan pelabelan pada 5 ‘ujung untai dengan penanda fosfor 32, kemudian modifikasi kimia dari basa nitrogen terjadi dan dipisahkan. Akhirnya terjadi pembelahan daerah basi.

Pertama rantai yang akan diurutkan dipersingkat menjadi segmen yang lebih kecil. Langkah ini dilakukan dengan enzim restriksi, sehingga menghasilkan ujung yang menonjol.

Selanjutnya, reaksi dilakukan dengan alkali fosfatase, yang tujuannya adalah untuk menghilangkan gugus fosfat. Dengan demikian, polinukleotida kinase dapat digunakan untuk melakukan pelabelan.

Rantai didenaturasi (dua untai terbuka). Kemudian bahan kimia diterapkan. Reaksi pembelahan ini dilakukan dengan cara yang terkendali dan diketahui jenis ikatan apa yang diputus oleh masing-masing bahan kimia yang digunakan.

Membaca hasil

Seperti dalam metode Sanger, pembacaan hasil melibatkan pemisahan berdasarkan ukuran rantai yang diperoleh dalam sistem elektroforesis. Sistem yang terdiri dari poliakrilamida memungkinkan memperoleh resolusi yang sangat memadai untuk membaca gel.

Urutan besar-besaran

Urutan besar-besaran mencakup serangkaian metode baru, disingkat NGS, dari bahasa Inggris ” Next Generation Sequencing “.

Metode yang diklasifikasikan sebagai NGS memerlukan langkah amplifikasi DNA sebelumnya (tidak bekerja dengan molekul tunggal). Selain itu, platform yang digunakan sangat bervariasi. Prinsip-prinsip metode yang paling populer akan dijelaskan di bawah ini:

Pirosequencing

Ini melibatkan pemantauan pelepasan pirofosfat, yang terjadi setiap kali nukleotida baru ditambahkan ke untai DNA. Sistem enzim digabungkan, sehingga emisi cahaya (yang dapat dideteksi oleh kamera) terjadi setiap kali nukleotida baru dimasukkan.

Prosesnya dimulai dengan inkubasi terpisah dari setiap basa nitrogen untuk memverifikasi apakah ada emisi cahaya atau tidak. Pyrosequencing dapat membaca untaian panjang, tetapi tingkat kesalahan yang ditemukan tinggi.

Urutan sintesis

Ini melibatkan penggabungan nukleotida berlabel. Komponen fluoresen ini ditambahkan, dicuci, dan nukleotida yang tergabung dicatat. Kemudian, label nukleotida dihapus, dan sintesis untai dapat dilanjutkan. Pada langkah berikutnya, nukleotida berlabel juga akan dimasukkan, dan langkah-langkah tersebut akan diulang.

Kelemahan teknik ini terjadi ketika penanda fluoresen tidak sepenuhnya dihilangkan. Emisi ini menciptakan kesalahan latar belakang, menghasilkan kesalahan yang signifikan.

Urutan ligasi

Teknik ini berbeda dari yang lain, karena tidak menggunakan DNA polimerase. Sebaliknya, enzim kunci untuk metodologi ini adalah ligase. Di sini fragmen DNA berlabel fluoresensi digunakan, diikat oleh enzim dan terdeteksi.

Masalah terbesar dengan teknik ini adalah pendeknya panjang fragmen yang mampu diproses.

Urutan Ion Torrent

Teknik ini didasarkan pada pengukuran ion H + yang dilepaskan setiap kali nukleotida baru dimasukkan. Prinsipnya sangat mirip dengan pyrosequencing, tetapi jauh lebih murah.

Contoh

Urutan genom manusia

Pengurutan genom manusia telah menjadi salah satu tantangan paling menjanjikan dalam biologi, serta menjadi salah satu persaingan paling terkenal dalam sejarah sains. Bahkan, bagi para ilmuwan yang terlibat dalam proyek tersebut, pengurutan genom menjadi sebuah kompetisi.

Pada tahun 1990 ia memulai apa yang disebut “proyek genom manusia”, yang dipimpin oleh ilmuwan terkenal, pemenang Hadiah Nobel, James Watson. Setelah satu tahun, pada tahun 1991, Venter menerima tantangan untuk “mengalahkan” Watson dan mengurutkan genom di depannya. Namun, pada tahun 1992, Watson pensiun dan perintah diambil oleh peneliti lain.

Pada tahun 1995 Venter mengumumkan keberhasilannya dalam pengurutan lengkap genom bakteri dengan metode pengurutan acak. Demikian pula, tim lawan mengumumkan setahun kemudian urutan genom ragi.

Pada tahun 2000 gelar dihentikan. Kedua perusahaan menerbitkan hasil awal genom mereka di dua jurnal sains paling bergengsi: Nature and Science.

Namun, para ilmuwan terus bekerja untuk memperbaiki proposal tersebut, dan pada tahun 2006 urutan kromosom manusia tertentu diselesaikan.

Penting dan aplikasi

Mengetahui urutan nukleotida dalam molekul penting seperti DNA sangat berharga bagi ahli biologi dan profesional terkait. Rantai polinukleotida ini berisi semua informasi yang diperlukan untuk pengembangan dan pemeliharaan semua bentuk kehidupan.

Untuk alasan ini, pengetahuan tentang urutan ini sangat penting untuk penelitian biologi. Pada dasarnya, pengurutan memungkinkan untuk mengukur salah satu sifat paling penting dari sistem biologis dan untuk menetapkan perbedaan di antara mereka.

Sekuensing banyak digunakan oleh ahli taksonomi dan ahli sistematika, karena sekuens DNA tertentu memungkinkan untuk menetapkan kriteria untuk menyimpulkan apakah dua organisme termasuk dalam spesies yang sama atau tidak, selain dapat mengajukan hipotesis tentang hubungan filogenetik di antara mereka.

Selain itu, pengurutan DNA memiliki aplikasi dalam kedokteran dan diagnostik. Misalnya, ada sistem yang murah dan dapat diakses yang, melalui pengurutan, memungkinkan untuk mengevaluasi kecenderungan untuk mengembangkan penyakit tertentu (seperti kanker) menggunakan apa yang disebut polimorfisme nukleotida tunggal (SNP).

Investigasi jenis kriminal dan forensik juga telah diperkaya dengan teknik pengurutan, yang dapat digunakan sebagai bukti yang dapat diandalkan tentang partisipasi individu tertentu dalam suatu kejahatan.

Referensi

  1. Heather, JM, & Rantai, B. (2016). Urutan sekuenser: sejarah sekuensing DNA. Genomik , 107 (1), 1-8.
  2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK, & Mardis, ER (2013). Revolusi pengurutan generasi berikutnya dan dampaknya pada genomik. Sel , 155 (1), 27-38.
  3. Retribusi, J. (2010). Persaingan ilmiah. Dari Galileo ke proyek genom manusia . Redaksi Paraninfo.
  4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, AR (1977). Pengurutan DNA dengan inhibitor pemutus rantai. Prosiding akademi ilmu pengetahuan nasional , 74 (12), 5463-5467.
  5. Schuster, SC (2007). Pengurutan generasi berikutnya mengubah biologi saat ini. Metode alam , 5 (1), 16.
  6. Xu, J. (Ed.). (2014). Sequencing generasi berikutnya . Pers Akademik Caister.