Lowenstein-Jensen media adalah medium padat selektif untuk isolasi dan perkembangan bakteri dari Mycobacterium genus, seperti Mycobacterium tuberculosis , M. avium , antara lain, dengan pengecualian dari spesies leprae, yang tidak culturable.
Bakteri dari genus Mycobacterium tidak dapat tumbuh pada media kultur konvensional, oleh karena itu perlu dirancang media khusus untuk isolasinya. Media asli dibuat oleh Löwenstein dan kemudian dimodifikasi oleh Jensen.
Medium Lowenstein-Jensen dengan koloni Mycobacterium tuberculosis. Sumber: Agarwal et al / BioMed Central Ltd., milik Biology Image Library
Modifikasi terdiri dari penghapusan pewarna merah Kongo, menggantinya dengan konsentrasi yang lebih tinggi dari perunggu hijau. Ini juga mengubah konsentrasi magnesium sitrat dan monopotassium fosfat.
Medium Lowenstein-Jensen saat ini mengandung tepung kentang, asparagin, magnesium sitrat, monopotassium phosphate, magnesium sulfat, malachite green, asam nalidiksat, sikloheksimida, linkomisin, telur kocok, gliserin, dan air.
Mycobacteria biasanya diisolasi dari tempat yang tidak steril, seperti dahak, urin, abses, dan lain-lain. Ini berarti bahwa sebagian besar sampel akan mengandung mikrobiota biasa di daerah tersebut, ditambah patogen.
Itulah sebabnya media Löwenstein-Jensen mengandung serangkaian inhibitor dalam komposisinya yang diwakili oleh malachite green, antibiotik dan antijamur.
Selain itu, sampel situs yang tidak steril harus didekontaminasi dan dinetralkan sebelum disemai pada media Löwenstein-Jensen.
Indeks artikel
Dasar
Kehadiran telur dan gliserin dalam media Lowenstein-Jensen merangsang pertumbuhan mikobakteri karena mereka menyediakan asam lemak dan protein yang diperlukan untuk perkembangan mikroorganisme ini.
Medium Löwenstein-Jensen mengandung malachite green, yang merupakan penghambat mikrobiota yang menyertainya. Tetapi juga mengandung asam nalidiksat (35 g/mL), yang menghambat mikrobiota Gram negatif, sikloheksimida (400 g/mL), yang menghambat jamur dan khamir saprofit, dan lincomycin (2 /mL), yang menghambat mikrobiota Gram positif. .
Beberapa perusahaan komersial lebih suka menambahkan kombinasi antibiotik berikut: polimiksin B 200.000 unit/L, amfoterisin B 10 mg/L, karbenisilin 50 mg/L dan trimetoprim 10 mg/L.
Media ini tidak mengandung agar-agar, oleh karena itu pemadatan media terjadi karena koagulasi albumin yang ada dalam telur selama sterilisasi.
Persiapan
Timbang 37,3 g media dehidrasi dalam 600 ml air suling yang sebelumnya telah ditambahkan 12 ml gliserol. Campuran dipanaskan, sering diaduk sampai benar-benar larut. Autoclave media pada 121 ° C selama 15 menit.
Di sisi lain, suspensi homogen 1000 ml telur segar harus disiapkan dalam kondisi aseptik. Tambahkan suspensi telur ke dalam 600 ml media yang disiapkan pada suhu 50 – 60 ° C, hindari gelembung udara.
Larutan antibiotik juga ditambahkan setelah autoklaf.
Tuangkan media ke dalam tabung reaksi tertutup ulir steril. Panaskan tabung pada 85 ° C selama 45 menit dalam posisi miring.
Warna media yang disiapkan adalah hijau aquamarine dan dapat menunjukkan bintik-bintik keputihan karena adanya lipid dari telur.
PH media harus 7,2 ± 0,2
Simpan tabung di lemari es dan terlindung dari cahaya langsung sampai digunakan. Tempel sebelum disemai.
Ada modifikasi media yang disebut “Modifikasi Gruft dari Löwenstein Jensen”. Ini mengandung senyawa yang sama seperti media klasik tetapi RNA-5mg / 100 mL ditambahkan, dan sebagai inhibitor mengandung malachite green 0,025 g / 100 mL, penisilin 50 U / mL dan asam nalidiksat 35 ug / mL.
Kegunaan
Medium Lowenstein-Jensen digunakan untuk isolasi mikobakteri dari berbagai jenis sampel. Pewarnaan Ziehl-Neelsen direkomendasikan untuk setiap spesimen yang dicurigai adanya mikobakteri.
Beberapa sampel berasal dari tempat yang steril tetapi yang lain tidak. Sampel yang tidak steril harus didekontaminasi sebagaimana mestinya:
Dahak
Sampel dahak harus didekontaminasi sebagai berikut: tentukan jumlah sampel dahak dalam ml dan tambahkan jumlah yang sama NaOH 4% ke sampel dan inkubasi pada suhu 37 ° C.
Kocok campuran secara teratur selama periode 30 menit. Selanjutnya sentrifus pada 3000 RPM selama 30 menit.
Buang supernatan di atas larutan desinfektan fenolik. Gunakan sedimen untuk disemai, tetapi pH harus dinetralkan terlebih dahulu.
Untuk menetralisir sedimen, 5% H 2 SO 4 digunakan di hadapan indikator merah fenol hingga mencapai pH netral yang menghasilkan warna salmon.
Bilas lambung , bilas bronkial, dan aspirasi bronkial
Dalam hal ini, sampel harus disentrifugasi pada 3000 RPM selama 30 menit. Supernatan dibuang dan pelet digunakan. Untuk dekontaminasi sedimen, tambahkan 3 ml NaOH 4% dan sering diaduk pada suhu 37 ° C selama setengah jam.
Sentrifugasi kembali, supernatan dibuang dan pelet digunakan. Yang terakhir harus dinetralkan seperti yang dijelaskan dalam sampel dahak.
Air seni
Biarkan sampel mengendap di lemari es selama 24 jam. Pisahkan supernatannya. Pelet yang tersisa harus disentrifugasi selama 30 menit pada 3000 RMP. Buang kembali supernatannya dan susun kembali pelet dengan 3 ml larutan fisiologis steril.
Tambahkan 3 ml NaOH 4% dan lanjutkan ke dekontaminasi dan netralisasi seperti yang dijelaskan sebelumnya.
Cairan asites, cairan pleura, cairan serebrospinal
Dalam jenis sampel ini disentrifugasi dan supernatannya dibuang. Lakukan Gram pada sedimen atau amati langsung di bawah mikroskop; Jika tidak ada bakteri yang diamati, langkah dekontaminasi tidak diperlukan, begitu pula langkah netralisasi.
Dalam hal ini sampel dapat disemai secara langsung menggunakan sedimen. Jika ada bakteri, lanjutkan dengan dekontaminasi dan netralisasi seperti dijelaskan di atas.
Biopsi
Untuk sampel jenis ini, 5 ml air suling harus ditambahkan ke sentrifus kemudian pada 1500 RPM selama 10 menit. Buang supernatan dan sentrifus kembali pelet pada 3500 RPM selama 30 menit. Gunakan sedimen untuk menabur media kultur.
Usap laring
Usap harus ditempatkan dalam tabung steril yang berisi air suling dengan bagian yang sama dan NaOH 4%. Usap harus ditekan ke dinding tabung sehingga sampel diencerkan dalam cairan. Centrifuge dan gunakan sedimen. Menetralisir sedimen seperti yang sudah dijelaskan.
Ditaburkan
Medium Lowenstein-Jensen diinokulasi dengan menambahkan 0,5 ml sampel pada permukaan medium. Putar tabung untuk mendistribusikan sampel ke seluruh media. Jangan gunakan pegangan platina.
Tabung kedua yang berisi media Stonebrink dapat disemai untuk mengisolasi Mycobacterium bovis dan spesies lain yang tidak tumbuh pada media Löwenstein-Jensen.
Inkubasi
Tabung yang diinokulasi diinkubasi secara aerobik pada suhu 37 ° C, dengan tutup sedikit longgar dan miring pada sekitar 5 ° dan terlindung dari cahaya. Lingkungan dapat diperkaya dengan 5-10% karbon dioksida. Periksa kultur dua kali seminggu sampai koloni muncul.
Ketika sampel telah diserap, tutupnya dikencangkan. Masa inkubasi maksimal 8 minggu, jika setelah waktu tersebut tidak ada pertumbuhan, maka dilaporkan negatif.
QA
Strain berikut dapat digunakan sebagai kontrol kualitas:
Mycobacterium tuberculosis ATCC 27.294, Mycobacterium kansasii ATCC 12.478, Mycobacterium avium ATCC 19.291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus 320of ATCC 19.645, Cryptococcus 320of ATCC 19645of nematococcus
Perkembangan yang sangat baik diharapkan untuk tiga spesies pertama yang disebutkan, untuk pertumbuhan M. fortuitum harus baik, sedangkan untuk M. bovis pertumbuhan diharapkan sedikit atau tidak sama sekali. Sedangkan spesies selain genus Mycobacterium harus dihambat sepenuhnya.
Keterbatasan
Media yang disiapkan harus terlindung dari cahaya, paparan cahaya yang terlalu lama menyebabkan media berubah dari hijau menjadi biru, dalam hal ini media tidak dapat digunakan lagi. Ini karena perunggu hijau bersifat fotosensitif.
Media, karena mengandung telur, dapat dengan mudah terkontaminasi jika tidak ditangani secara aseptik. Dapat larut jika terkontaminasi bakteri proteolitik.
Budidaya dan manipulasi bakteri dari genus Mycobacterium membutuhkan personel yang berkualifikasi, yang mengetahui langkah-langkah keamanan hayati yang harus diikuti untuk menghindari kontaminasi atau kontaminasi orang lain.
HCl tidak boleh digunakan dalam langkah netralisasi karena pembentukan natrium klorida, yang dapat menjadi racun bagi basil Koch.
Sampel harus disimpan dalam lemari es dan terlindung dari cahaya saat tidak diproses.
Referensi
- Laboratorium Francisco Soria Melguizo. 2009. Medium selektif Lowenstein-Jensen. Tersedia di: f-soria.es
- Laboratorium Britannia. 2017. Media Lowenstein-Jensen. Tersedia di: britanialab.com.
- Laboratorium Neogen. medium Lowenstein-Jensen. Tersedia di: foodsafety.neogen.com.
- “Media Lowenstein-Jensen.” Wikipedia, Ensiklopedia Bebas . 20 Nov 2018, 15:15 UTC. 24 Apr 2019, 18:34. wikipedia.org
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosa Mikrobiologi. edisi ke-5. Editorial Panamericana SA Argentina.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnosa Mikrobiologi Bailey & Scott. 12 edisi Editorial Panamericana SA Argentina.
- Mac Faddin J. (2003). Tes biokimia untuk identifikasi bakteri yang penting secara klinis. edisi ke-3 Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
