Mueller Hinton Agar tidak selektif, media nutrisi yang solid terdiri dari infus daging, asam kasein pepton, pati, agar dan air suling . Media ini memungkinkan pertumbuhan mikroba yang sangat baik untuk sebagian besar bakteri yang tumbuh cepat.
Awalnya dibuat oleh John Howard Müeller dan Jane Hinton untuk mengisolasi bakteri yang membutuhkan nutrisi seperti Neisseria gonorrhoeae dan Neisseria meningitidis. Namun, karena karakteristiknya, ternyata ideal untuk studi kerentanan terhadap antibiotik, memberikan hasil yang andal dan dapat direproduksi.
Antibiogram (agar Müeller Hinton). Sumber: Dr Graham Beards di en.wikipedia
Oleh karena itu, agar Müeller Hinton adalah media kultur yang diterima oleh Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) dan European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, untuk kinerja uji kepekaan antimikroba dengan metode difusi cakram Kirby dan Bauer.
Indeks artikel
Dasar
Karena merupakan media nutrisi non-selektif, sangat baik untuk pertumbuhan sebagian besar bakteri patogen.
Di sisi lain, komposisinya yang sederhana membuat zat mudah berdifusi di atasnya, menjadi karakteristik penting untuk uji kepekaan dengan metode difusi cakram.
Karakteristik lainnya adalah mengandung inhibitor dalam jumlah rendah, yang memungkinkan sulfonamida, trimetoprim dan tetrasiklin dievaluasi secara efektif.
Namun, harus diingat bahwa media harus memenuhi kondisi tertentu untuk memastikan berfungsi dengan baik, termasuk:
Penyesuaian pH, kedalaman agar dan konsentrasi timin, timidin, Ca ++ , Mg ++ dan Zn ++ yang sesuai .
Perlu juga diketahui bahwa metodologi tersebut terstandarisasi dan oleh karena itu semua parameter harus dipenuhi, seperti:
Konsentrasi inokulum, konsentrasi dan konservasi cakram antibiotik, penempatan jumlah cakram yang sesuai pada agar-agar, jarak antara satu cakram dengan yang lain, penempatan strategis antibiotik tertentu, atmosfer , suhu dan waktu. inkubasi.
Persiapan
Timbang 37 g media Müeller Hinton dehidrasi dan larutkan dalam 1 liter air suling. Panaskan media sambil diaduk untuk membantu pembubaran. Rebus selama 1 menit.
Autoklaf untuk mensterilkan pada 121 ° C selama 15 menit. Saat mengeluarkan dari autoklaf, labu harus ditempatkan dalam penangas air pada suhu 50 ° C hingga dingin. Tuang 25 sampai 30 ml ke dalam cawan petri steril berdiameter 10 cm.
Pelat harus memiliki ketebalan rata-rata 4 mm (ideal), kisaran 3-5 mm diperbolehkan.
Jika diinginkan untuk menyiapkan agar darah dengan menggunakan agar Müeller Hinton sebagai dasar, tuangkan 5% darah domba steril dan didefibrinasi sebelum disajikan di piring.
PH akhir media harus antara 7,2 hingga 7,4.
Investasikan dan simpan di lemari es, sampai digunakan. Biarkan piring mencapai suhu kamar sebelum digunakan.
Warna media yang disiapkan adalah krem muda.
Kegunaan
Ini digunakan untuk melakukan antibiogram atau tes kerentanan antibiotik terhadap sebagian besar patogen non-rewel yang tumbuh cepat.
Jika agar dilengkapi dengan darah, digunakan untuk melakukan antibiogram mikroorganisme yang menuntut seperti: Streptococcus pneumoniae , Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, antara lain. Ini juga telah digunakan untuk mengisolasi Legionella pneumophila .
Teknik antibiogram
Sebelum melakukan antibiogram tersebut, solusi setara bakteri 1,5 x 10 8 sel harus siap .
Untuk ini, 3 hingga 4 koloni kultur murni diambil dan disuspensikan dalam kaldu trypticase kedelai atau kaldu Müeller Hinton, diinkubasi selama 2 hingga 6 jam dan konsentrasinya disesuaikan dengan saline steril, bandingkan dengan standar Mac Farland 0,5 %.
Jika mereka membutuhkan mikroorganisme, koloni dapat disuspensikan secara langsung hingga konsentrasi 0,5% Mac Farland. Selanjutnya, pelat Müeller Hinton diunggulkan dengan kapas yang diresapi dengan larutan bakteri yang disiapkan.
Untuk melakukan ini, kapas dicelupkan ke dalam larutan dan kemudian kelebihan cairan dihilangkan dengan menekan dinding tabung. Segera setelah itu, usap dilewatkan ke seluruh permukaan, tidak meninggalkan tempat yang tidak tersentuh, kemudian pelat diputar sedikit dan disemai lagi. Operasi diulang 2 kali lagi.
Diamkan selama 10 menit lalu masukkan cakram antibiotik dengan forsep steril, sisakan celah 24 mm di antara keduanya. Setelah meletakkan setiap cakram pada agar-agar, tekan perlahan setiap cakram dengan forsep untuk memastikan melekat dengan baik.
Setelah proses selesai, plate dibalik dan diinkubasi pada suhu 35-37°C secara aerobiosis selama 16 sampai 18 jam. Jika itu adalah mikroorganisme yang menuntut, itu mungkin memerlukan mikroaerofilia dan jika antibiogram mengandung cakram oksasilin, itu harus dibaca setelah 24 jam.
Penggaris digunakan untuk mengukur diameter setiap lingkaran. Hasilnya harus dicatat dalam mm. Selanjutnya, nilai yang diperoleh dikorelasikan dengan tabel titik potong yang diterbitkan oleh manual CLSI saat ini.
Pengukuran halo inhibisi. Sumber: USCDCP, Pixnio.com
Laporkan sebagai sensitif (S), menengah (I), atau resisten (R), tergantung kasusnya.
Antibiotik dipilih sesuai dengan mikroorganisme yang diisolasi dan jenis infeksi yang dihasilkannya.
Terkadang penempatan antibiotik yang strategis harus diperhitungkan untuk menunjukkan pola fenotipik resistensi.
Penempatan cakram yang strategis pada agar Müeller Hinton
Untuk enterobakteri, cakram asam klavulanat harus ditempatkan pada sefalosporin generasi ke-3 dan ke-4. Pelebaran berbentuk telur menunjukkan bahwa galur adalah penghasil beta-laktamase spektrum luas (ESBL). Ini berarti bahwa pasien tidak boleh diobati dengan sefalosporin apa pun.
Ekspresi fenotipik produksi spektrum beta-laktamase (ESBL) diperpanjang dalam strain Escherichia coli. Sumber: Foto diambil oleh penulis MSc. Marielsa Gil
Pada Staphylococcus, penting untuk menempatkan cakram eritromisin atau azitromisin di depan cakram klindamisin (uji-D).
Halo yang resisten pada eritromisin dan pendataran pada halo klindamisin menunjukkan bahwa strain tersebut memiliki resistensi klindamisin yang dapat diinduksi strain (ICR). Ini berarti bahwa pengobatan dengan klindamisin tidak akan efektif.
Untuk mencari galur AMP C yang dapat diinduksi pada enterobakteri dan beberapa batang Gram negatif yang tidak memfermentasi, cakram ceftazidime, cefoxitin atau piperacillin tazobactan dihadapkan pada cakram imipenem, pada jarak 27 mm.
Halo yang rata di salah satu disk yang menghadap imipenem menunjukkan adanya AMP C yang dapat diinduksi.
Untuk mencari C-AMP konstitutif, disk kloksasilin 500 g dihadapkan dengan ceftazidime (30 g) dan dengan sefotaksim (30 g), pada jarak 25 mm. Halo yang melebar di salah satu sefalosporin menunjukkan kepositifan.
Disk kloksasilin juga dapat diganti dengan disk 9 mm kertas saring Whatman No. 6 yang diresapi dengan asam fenil borat (400 g) dengan jarak 18 mm. Ini ditafsirkan sama dengan yang sebelumnya.
Akhirnya, untuk menyelidiki produksi metallobetalaktamase terutama pada Pseudomonas aeruginosa , cakram yang diresapi dengan 10 l asam etilendiamintetraasetat (EDTA 750 g) dan asam tioglikolat (SMA 300 g) digunakan, yang berhadapan dengan cakram imipenem dan meropenem, pada jarak 15mm.
Tes positif jika ada pelebaran lingkaran imipenem atau meropenem menuju disk EDTA / SMA. Hasil ini harus dikonfirmasi dengan uji Hodge yang dimodifikasi.
Metode ini terdiri dari menginokulasi strain Escherichia coli ATCC 25922 pada pelat Müeller Hinton. Sebuah piringan imipenem ditempatkan di tengah piring dan kemudian garis dibuat dari piringan ke pinggiran dengan strain P. aeruginosa yang dicurigai. Hingga 4 strain dapat diuji per piring.
Tes akan positif jika ada zona distorsi halo imipenem di sekitar stretch mark.
Penyebab hasil yang salah
– Cakram antibiotik yang diawetkan dengan buruk dapat menghasilkan resistensi palsu. Misalnya, piringan oksasilin sangat rentan terhadap perubahan suhu.
-Sebuah pH media di bawah yang ditunjukkan (asam) menghasilkan lingkaran cahaya yang lebih kecil pada aminoglikosida dan makrolida (risiko resistensi palsu), dan lingkaran cahaya yang lebih besar pada penisilin, tetrasiklin dan novobiocin (risiko sensitivitas palsu).
-Jika pH di atas yang ditunjukkan (basa), efek yang dijelaskan di atas dibalik.
-Media dengan konsentrasi timin dan timidin tinggi memiliki pengaruh dengan secara signifikan mengurangi lingkaran cahaya penghambatan sulfonamida dan trimetoprim.
-Konsentrasi kalsium dan magnesium yang tinggi menghasilkan resistensi palsu dari aminoglikosida, polimiksin B dan tetrasiklin terhadap strain Pseudomonas aeruginosa .
-Konsentrasi rendah kalsium dan magnesium menghasilkan sensitivitas palsu aminoglikosida, polimiksin B dan tetrasiklin terhadap strain Pseudomonas aeruginosa .
-Keberadaan seng mempengaruhi hasil cakram carbapenem (imipenem, meropenem dan ertapenem).
-Ketebalan media di bawah 3mm akan menghasilkan hasil sensitivitas palsu, sedangkan ketebalan di atas 5 akan menghasilkan resistansi palsu.
-Mobilisasi cakram di antibiogram akan memberikan lingkaran cahaya yang cacat, karena pelepasan antibiotik segera.
– Inokulum yang sangat lemah mempengaruhi hasil, karena tidak akan ada pertumbuhan yang seragam atau konfluen dalam agar-agar, suatu kondisi yang diperlukan untuk dapat mengukur halo inhibisi, selain fakta bahwa halo dapat memberikan lebih besar dari biasanya.
-Inokula yang dimuat terlalu banyak dapat memberikan lingkaran cahaya yang lebih kecil dari biasanya.
-Tidak memperhatikan jarak antar disk menyebabkan satu lingkaran cahaya tumpang tindih dengan lingkaran lainnya dan tidak dapat dibaca dengan benar.
-Incubate dengan CO 2 meningkat ukuran lingkaran cahaya dari tetrasiklin dan methicillin cakram.
-Inkubasi pada suhu di bawah 35 ° C menghasilkan lingkaran cahaya yang lebih besar.
– Penambahan darah menurunkan ukuran halo sulfonamida.
Keterbatasan
Sensitivitas antibiotik yang ditunjukkan dalam antibiogram terhadap mikroorganisme ( in vitro ) bukanlah jaminan bahwa antibiotik itu akan bekerja secara in vivo .
QA
Untuk mengetahui apakah media mengandung timin dalam jumlah yang cukup, strain Enterococcus faecalis ATCC 29212 harus ditanam dan diuji kepekaannya terhadap trimetoprim sulfametoksazol (SXT), harus memberikan halo sama dengan atau> 20 mm agar memuaskan.
Referensi
- “Agar Muller-Hinton.” Wikipedia, Ensiklopedia Bebas . 16 Nov 2018, 12:23 UTC. 27 Januari 2019, 04:22 <https://es.wikipedia.org
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnosa Mikrobiologi Bailey & Scott. 12 edisi Editorial Panamericana SA Argentina.
- Cona E. Kondisi untuk studi kerentanan yang baik dengan uji difusi agar. Rev Chil Infect , 2002; 19 (2): 77-81
- Laboratorium Difco Francisco Soria Melguizo. Müeller Hinton agar dengan 5% darah domba. 2009.Tersedia di: http://f-soria.es
- Laboratorium Agar BD Müeller Hinton II. 2017.Tersedia di: .bd.com
- Laboratorium Britannia. Agar Muller Hinton. 2015.Tersedia di: britanialab.com
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosa Mikrobiologi. edisi ke-5. Editorial Panamericana SA Argentina.
- Martínez-Rojas D. Betalaktamase tipe AmpC: Umum dan metode untuk deteksi fenotipik. Pdt. Soc. Ven. Mikrobiol . 2009; 29 (2): 78-83. Tersedia di: scielo.org.
- Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Deteksi fenotip metallobetalaktamase pada isolat klinis Pseudomonas aeruginosa . Kasmera , 2012; 40 (2): 113-121. Tersedia di: scielo.org.
