DNA rekombinan (rDNA atau rDNA) merupakan molekul asam nukleat buatan dibuat di laboratorium, dengan mengintegrasikan dua segmen dari organisasi kepentingan. Ia juga dikenal sebagai DNA chimeric, berkat sifat hibridanya. Jenis DNA ini tidak ditemukan di alam.
Metodologi dasar untuk menghasilkannya meliputi: (a) pemilihan DNA target, dan penyisipannya ke dalam fragmen DNA lain (umumnya plasmid bakteri); (b) pengenalan plasmid ini ke dalam bakteri, (c) seleksi bakteri melalui antibiotik dan akhirnya (d) ekspresi gen.
Sumber: pixabay.com
Teknik ini mengambil keuntungan dari satu set enzim yang memungkinkan untuk menyalin dan menempelkan fragmen DNA tertentu menurut penilaian peneliti.
Tujuan dari teknologi rekombinan adalah, dalam banyak kasus, ekspresi protein (dikenal sebagai protein rekombinan) yang diinginkan oleh ahli biologi molekuler untuk penelitian masa depan atau untuk membuat protein nilai komersial dan terapeutik – seperti insulin manusia, misalnya.
Indeks artikel
Dasar-dasar teknik DNA rekombinan dan penggunaannya dalam rekayasa genetika
Dogma sentral biologi molekuler
Semua makhluk organik yang kita kenal memiliki beberapa karakteristik. Salah satunya adalah sifat materi genetik dan cara protein dibuat – sebuah proses yang dikenal sebagai “dogma” sentral biologi molekuler.
Dengan pengecualian beberapa virus, semua organisme menyimpan informasi genetik dalam DNA (asam deoksiribonukleat), dikumpulkan dengan cara yang sangat kompak dan terorganisir di dalam inti sel.
Untuk ekspresi gen, molekul DNA ditranskripsi menjadi RNA pembawa pesan, dan yang terakhir diterjemahkan ke dalam bahasa asam amino, bahan penyusun protein.
Apa itu DNA rekombinan?
Antara 1970-an dan 1980-an, ahli biologi molekuler mulai memanfaatkan proses yang terjadi secara alami di dalam sel dan mampu mengekstrapolasinya ke laboratorium.
Dengan cara ini, gen asal hewan (vertebrata, misalnya) dapat dimasukkan ke dalam segmen DNA dari bakteri; atau DNA bakteri dapat digabungkan dengan DNA virus. Dengan demikian, kita dapat mendefinisikan DNA rekombinan sebagai molekul yang terdiri dari DNA dari dua organisme yang berbeda.
Setelah molekul hibrida atau rekombinan ini dibuat, gen yang diinginkan diekspresikan. Dengan ekspresi kata kita ingin merujuk pada proses penerjemahan menjadi protein.
Enzim restriksi dan ligase: kunci proses
Unsur kunci untuk dapat mengembangkan teknologi DNA rekombinan adalah penemuan enzim restriksi.
Ini adalah molekul protein yang menunjukkan kemampuan untuk membelah DNA (nuklease) menjadi urutan tertentu, berfungsi sebagai “gunting molekul”. Fragmen yang dihasilkan oleh enzim ini disebut fragmen restriksi.
Enzim tersebut dapat menghasilkan pemotongan simetris pada urutan target (pada kedua rantai pada ketinggian yang sama) atau pemotongan asimetris. Aspek kunci dari kerja enzim restriksi adalah bahwa setelah pemutusan rantai diperoleh “ujung lepas” yang melengkapi ujung lain yang dipotong oleh enzim yang sama.
Beberapa contohnya adalah ECOR 1 dan Sma 1. Saat ini lebih dari 200 jenis enzim restriksi telah dikenal dan tersedia secara komersial.
Agar berguna, gunting harus disertai dengan lem. Tindakan penyegelan DNA ini (sebelumnya diperlakukan dengan enzim restriksi) dilakukan oleh ligase.
Teknik: bagaimana DNA suatu organisme dimodifikasi secara artifisial di laboratorium?
Kita sekarang akan menjelaskan langkah-langkah utama yang dibutuhkan oleh teknologi DNA rekombinan. Semua dilakukan oleh para profesional di laboratorium biologi molekuler.
Apa itu “klon”?
Sebelum melanjutkan dengan protokol eksperimental, kita harus mencatat bahwa dalam biologi molekuler dan bioteknologi, istilah “kloning” dan kata kerja “kloning” digunakan secara luas. Hal ini dapat menyebabkan kebingungan.
Dalam konteks ini, kita tidak mengacu pada kloning seluruh organisme (seperti dalam kasus domba Dolly yang terkenal, misalnya), tetapi pada kloning sepotong DNA, yang dapat berupa gen. Artinya, menghasilkan banyak salinan – identik secara genetik – dari urutan.
1. Isolasi dan perolehan DNA
Langkah pertama adalah memutuskan urutan mana yang ingin Anda gunakan. Ini sepenuhnya tergantung pada peneliti dan tujuan pekerjaannya. DNA ini kemudian harus diisolasi dan dimurnikan. Metode dan prosedur untuk mencapai ini bergantung pada tubuh dan jaringan.
Umumnya, sebagian jaringan diambil dan diperlakukan dalam buffer lisis dengan proteinase K (enzim proteolitik) dan kemudian DNA diekstraksi. Selanjutnya, materi genetik terfragmentasi menjadi fragmen-fragmen kecil.
2. Vektor kloning
Setelah langkah-langkah persiapan, peneliti berusaha untuk memperkenalkan segmen DNA yang diinginkan ke dalam vektor kloning. Mulai sekarang kita akan menyebut segmen DNA target DNA ini.
Plasmid
Salah satu vektor yang paling banyak digunakan dalam plasmid asal bakteri. Plasmid adalah molekul DNA melingkar beruntai ganda yang ditemukan secara alami pada bakteri. Mereka asing bagi kromosom bakteri – yaitu, mereka ekstrakromosomal, dan ditemukan secara alami di prokariota ini.
Unsur dasar vektor adalah: (a) asal replikasi, yang memungkinkan sintesis DNA; (b) agen seleksi, yang memungkinkan untuk mengidentifikasi organisme yang membawa plasmid dengan DNA target, seperti resistensi terhadap beberapa antibiotik; dan (c) situs multikloning, di mana urutan yang akan dikenali oleh enzim restriksi ditemukan.
DNA rekombinan pertama yang berhasil di laboratorium diklon ke dalam plasmid pSC101 dari bakteri E. coli. Ini berisi situs restriksi untuk enzim restriksi EcoRI dan gen resistensi antibiotik, selain asal replikasi.
Penyisipan DNA target dalam plasmid dilakukan dengan menggunakan alat molekuler enzim restriksi dan ligase yang dijelaskan pada bagian sebelumnya.
Jenis vektor yang tersisa
Selain plasmid, DNA dapat disisipkan ke vektor lain, seperti bakteriofag lambda, kosmid, YACs (kromosom buatan khamir), BACs (kromosom buatan bakteri), dan fagemid.
3. Pengenalan DNA rekombinan
Setelah molekul DNA rekombinan (gen yang diinginkan dalam plasmid atau vektor lain) telah diperoleh, molekul tersebut dimasukkan ke dalam organisme inang atau inang, yang dapat berupa bakteri.
Untuk memasukkan DNA asing ke dalam bakteri, teknik yang disebut transformasi bakteri digunakan, di mana organisme dikenai perlakuan dengan kation divalen yang membuatnya rentan terhadap pengambilan DNA.
Secara metodologis, kita tidak dapat menjamin bahwa 100% bakteri dalam kultur kita telah secara efektif mengambil molekul DNA rekombinan kita. Di sinilah bagian plasmid yang mengandung resistensi antibiotik berperan.
Dengan demikian, bakteri yang telah mengambil plasmid akan resisten terhadap antibiotik tertentu. Untuk menyeleksinya, cukup dengan pemberian antibiotik tersebut dan pengambilan yang selamat.
4. “Panen” protein
Setelah memilih bakteri dengan DNA rekombinan kita, kita melanjutkan untuk menggunakan mesin enzimatik inang untuk menghasilkan produk protein yang diinginkan. Saat bakteri berkembang biak, plasmid diturunkan ke keturunannya, sehingga tidak hilang selama pembelahan.
Prosedur ini menggunakan bakteri sebagai semacam “pabrik” protein. Nanti kita akan melihat bahwa prosedur ini sangat relevan dalam pengembangan perawatan medis yang efektif.
Setelah biakan siap dan bakteri telah menghasilkan sejumlah besar protein, sel dilisiskan atau terganggu. Ada berbagai macam teknik biokimia yang memungkinkan pemurnian protein menurut karakteristik fisikokimianya.
Dalam konteks eksperimental lain, kita mungkin tidak tertarik untuk menghasilkan protein, tetapi kita tertarik untuk mendapatkan urutan DNA itu sendiri . Jika ini masalahnya, plasmid akan digunakan untuk membuat banyak salinan dari fragmen yang diinginkan agar memiliki cukup DNA target untuk melakukan eksperimen yang relevan.
Kegunaan
Teknologi DNA rekombinan membuka kemungkinan tak terbatas dalam biologi molekuler, bioteknologi, kedokteran, dan bidang terkait lainnya. Kegunaannya yang paling menonjol adalah sebagai berikut.
Analisis genetik
Kegunaan pertama berhubungan langsung dengan laboratorium biologi molekuler. Teknologi DNA rekombinan memungkinkan peneliti untuk memahami fungsi normal gen, dan protein yang dihasilkan dapat digunakan dalam penelitian lebih lanjut.
Industri farmasi
Protein yang diproduksi menggunakan prosedur DNA rekombinan memiliki aplikasi dalam kedokteran. Dua contoh yang sangat relevan di lapangan adalah insulin manusia dan hormon pertumbuhan, yang diterapkan pada pasien yang kekurangan protein ini.
Berkat DNA rekombinan, protein ini dapat dihasilkan tanpa perlu mengekstraknya dari manusia lain, yang menunjukkan komplikasi metodologis tambahan dan risiko kesehatan. Ini telah membantu meningkatkan kualitas hidup pasien yang tak terhitung jumlahnya.
Referensi
- Baca, LEL, & lvarez, CLC (2015). Biologi 2 . Grupo Editorial Patria.
- Cooper, GM, Hausman, RE, & Hausman, RE (2000). Sel: pendekatan molekuler (Vol. 10). Washington, DC: Pers ASM.
- Devlin, TM (2004). Biokimia: buku teks dengan aplikasi klinis . saya terbalik.
- Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). Peran Teknologi DNA Rekombinan untuk Meningkatkan Kehidupan. Jurnal internasional genomik , 2016 , 2405954.
- Mindán, FP, & Mindan, P. (1996). Anatomi patologis . Elsevier Spanyol.
- Tortora, GJ, Funke, BR, & Kasus, CL (2007). Pengantar mikrobiologi . Ed. Medis Panamerika.
- Itu, MJ (1989). Insulin manusia: obat pertama teknologi DNA. American Journal of Health-System Pharmacy , 46 (11_suppl), S9-S11.