Proteinase K: karakteristik, aktivitas enzimatik, aplikasi

Proteinase K: karakteristik, aktivitas enzimatik, aplikasi

K proteinase adalah enzim milik kelompok protease serin, yaitu, memiliki dalam tengahnya aktif secara katalitik serin asam amino dan memiliki fungsi melanggar ikatan peptida dengan hidrolisis. Pada gilirannya, enzim ini termasuk dalam keluarga protein subtilisin (S8 peptidase).

Proteinase K memiliki berat molekul (MW) 28.900 dalton dan diisolasi untuk pertama kalinya pada tahun 1974 dalam ekstrak album jamur Engyodontium , yang sebelumnya dikenal sebagai album Tritirachium Limber.

Proteinase K

Struktur molekul Proteinase K. Sumber: Lykchiniadis [CC BY-SA 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0)]

Ia memiliki kapasitas proteolitik yang tinggi, ditunjukkan dengan kemampuannya mendegradasi keratin yang ada di rambut. Kata keratin dalam bahasa Inggris dieja “keratin”, karena itu disebut “proteinase K”.

Karena kekuatannya yang tinggi untuk membelah protein asli, enzim ini berguna dalam berbagai teknik biologi molekuler. Ini terutama digunakan untuk mengisolasi dan menyiapkan asam nukleat dengan berat molekul tinggi (MW).

Proteinase K bekerja dengan melepaskan DNA inti, sementara menghancurkan protein dan menonaktifkan RNase dan DNase, yaitu menghilangkan nuklease dalam persiapan DNA dan RNA .

Di sisi lain, telah terlihat bahwa proteinase K dapat menghidrolisis beberapa protein asli terdenaturasi, yang telah membangkitkan minat para peneliti untuk digunakan dalam studi protein prion (PrP C ).

Namun, terlepas dari potensi proteolitiknya yang tinggi , ada protein yang resisten terhadap kerja proteinase K. Diantaranya adalah beberapa protein abnormal yang disebut prion (PrP Sc ), yang terkait dengan ensefalopati spongiform menular.

Indeks artikel

Karakteristik proteinase K

Proteinase K memiliki struktur tersier yang terdiri dari tiga lapisan, dengan lembaran tujuh rantai yang disisipkan di antara dua lapisan heliks. Karena termasuk dalam famili peptidase S8, ia dicirikan dengan memiliki triad katalitik di situs aktifnya, yang urutannya berurutan (Asp, His dan Ser), yang membedakannya dari famili peptidase lainnya.

Enzim dari kelompok protease serin ini dicirikan dengan menghidrolisis ikatan peptida yang dekat dengan gugus karboksilat asam amino alifatik dan aromatik.

Di sisi lain, ia mampu bertindak di hadapan zat korosif tertentu, seperti natrium dodesil sulfat (SDS), Tris-HCL dan EDTA, yang digunakan untuk membantu denaturasi protein, menyebabkan mereka kehilangan struktur aslinya. .

Ini adalah langkah awal dalam persiapan protein untuk teknik elektroforesis. Kisaran pH di mana proteinase K bekerja cukup lebar (2,0 hingga 12,0), dengan pH optimum antara 7,5 hingga 12,0, dan titik isoelektriknya adalah 8,9. Seperti dapat dilihat, ia aktif terhadap kisaran pH yang sangat luas.

Karakteristik lain yang menonjol pada proteinase K adalah stabilitasnya dengan adanya suhu tinggi (50 – 60 ° C).

Aktivitas enzimatik

Proteinase K membutuhkan keberadaan ion kalsium, meskipun hal ini tidak mempengaruhi aktivitasnya, jika penting untuk menjaga stabilitasnya.

Agar proteinase K mencerna substrat sepenuhnya, diperlukan waktu kontak sekitar 5 menit hingga 2 jam.

Namun, dalam hal ini, Daza et al., Membandingkan kemurnian DNA yang diperoleh pada berbagai waktu pemaparan terhadap proteinase K, dan menyimpulkan bahwa inkubasi yang berkepanjangan (hingga 24 jam) secara signifikan meningkatkan kualitas DNA.

Sekarang, dalam kaitannya dengan konsentrasi enzim proteinase K yang digunakan dalam protokol yang berbeda, dapat dikatakan sangat bervariasi.

Ini dapat digunakan dari konsentrasi yang sangat rendah (5 g / ml) hingga konsentrasi 500 g / ml. Tetapi konsentrasi kerja yang paling sering berkisar antara 50–100μg / ml, terutama untuk pencernaan protein dan inaktivasi nuklease. Meskipun untuk perawatan jaringan diperlukan konsentrasi 2 mg / ml.

Kegunaan

Penerapannya sangat luas dan dapat diringkas sebagai berikut:

-Ini digunakan dalam pencernaan protein dan ekstraksi DNA dengan berbagai metode seperti: salting-out, PK-SDS, setil-trimetil amonium bromida (CTAB), kalium asetat yang dimodifikasi dan ekstraksi dengan natrium iodida.

-Inaktivasi nuklease (RNase dan DNase).

-Dalam teknik hibridisasi in situ (HIS), untuk membantu pelepasan asam nukleat, selain menghilangkan protein yang tidak diinginkan.

-Modifikasi protein.

-Pada tingkat penelitian, dalam berbagai penelitian.

Keuntungan dari proteinase K

Beberapa studi perbandingan telah dilakukan antara teknik ekstraksi DNA yang menggunakan Proteinase K, dengan yang tidak menggunakan dan semuanya menyimpulkan bahwa ada manfaat yang lebih besar ketika menggunakan enzim. Keuntungannya antara lain sebagai berikut:

-DNA dengan berat molekul tinggi, kualitas dan kemurnian tinggi diperoleh.

-DNA yang diekstraksi stabil hingga 3 bulan.

DNA yang diekstraksi dapat digunakan dalam teknik berikut: Southern blot, polymerase chain reaction (PCR), elektroforesis, dan lain-lain.

Protein yang resisten terhadap proteinase K

Berbagai penyelidikan telah menyimpulkan bahwa prion (protein PrPSc toksik abnormal) berbeda dari protein PrPC (asli) karena resisten terhadap aksi proteinase K, sedangkan PrPC sensitif terhadap aksinya.

Penulis lain telah menggambarkan bahwa dalam struktur PrPSc ada bagian yang sensitif dan bagian lain yang resisten terhadap proteinase K. Namun, kedua bagian tersebut sama-sama beracun dan menular.

Di sisi lain, Bastian et al Pada tahun 1987 mengisolasi 4 protein 28, 30, 66 dan 76 kda dari spesies Spiroplasma mirum . Semua ditemukan resisten terhadap aksi proteinase K dan juga memiliki reaksi silang dengan beberapa prion.

Diketahui bahwa spesies ini dapat menyebabkan katarak dan kerusakan neurologis yang signifikan dan karena temuan ilmiah Bastian, di antara investigasi lainnya, upaya telah dilakukan untuk menghubungkan mikroorganisme ini dengan ensefalopati spongiform menular.

Namun, etiologi patologi neurologis degeneratif ini terus dikaitkan dengan prion hari ini.

Dalam pengertian ini, Butler et al Pada tahun 1991 mengidentifikasi dan mengkarakterisasi kelas protein yang resisten terhadap proteinase K sebesar 40 kda dari dua galur Mycoplasma hyorhini. Patogen ini mempengaruhi babi, menginfeksi jaringan mereka, tetapi dalam kasus ini tidak ada reaksi silang dengan prion yang diuji.

Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menjelaskan banyak hal yang tidak diketahui dalam hal ini.

Referensi

  1. Bastian F, Jennings R, dan Gardner W. 1987. Antiserum untuk protein fibril terkait scrapie bereaksi silang dengan protein fibril mirum Spiroplasma . J.klin. Mikrobiol. 25: 2430-2431.
  2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. Evaluasi ekstraksi DNA dan metode pemurnian dari jaringan otot tetap formaldehida dari mayat tak dikenal. Majalah Med , 2014; 22 (1): 42-49,
  3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E, dan McGarrity G. Identifikasi dan Karakterisasi Protein K-Resistant Proteinase di Anggota Kelas Mollicutes. Infeksi dan Kekebalan, 1991, 59 (3): 1037-1042
  4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, dkk. Perbandingan dua protokol ekstraksi DNA Trypanosoma cruzi yang ditumbuhkan dalam media axenic. Pdt. Peru. Med.Exp.Kesehatan Masyarakat 2014; 31 (2): 222-227. Tersedia di: scielo.org
  5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E dan Palma W. Penentuan efektivitas lima protokol ekstraksi DNA dari bahan parafin untuk studi molekuler. Rev Méd Univ Kosta Rika. 2007; 1 (1): 10-19.