spora pewarnaan adalah metodologi yang digunakan untuk mewarnai struktur perlawanan yang membentuk beberapa genera bakteri ketika dalam kondisi yang tidak menguntungkan; Struktur ini sesuai dengan bentuk kelangsungan hidup.
Ada banyak genera yang membentuk spora; namun, yang utama adalah Bacillus dan Clostridium . Genus ini dianggap lebih relevan karena memiliki spesies patogen bagi manusia.
Pewarnaan spora dengan metode Shaeffer – Fulton atau Wirtz-Conklin. Dan juga (pengunggah asli) [GFDL (http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html) atau CC-BY-SA-3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/ )], dari Wikimedia Commons
Setiap basil dapat menimbulkan spora. Pada saat pewarnaan sediaan, spora dapat ditemukan di dalam basil (endospora) atau di luarnya (eksospora). Dengan teknik pewarnaan konvensional untuk bakteri – seperti pewarnaan Gram – spora tidak berwarna.
Saat ini, ada beberapa metodologi pewarnaan yang mampu melewati struktur tebal spora untuk mewarnainya. Metodologi ini sangat bervariasi; Ini termasuk teknik Dorner, pewarnaan Möeller dan metodologi Shaeffer – Fulton, juga dikenal sebagai Wirtz-Conklin.
Dari semua teknik yang disebutkan, metodologi Shaeffer-Fulton adalah yang paling banyak digunakan di laboratorium rutin. Dinamai setelah dua ahli mikrobiologi yang menciptakan pewarnaan pada tahun 1930: Alicia Shaeffer dan MacDonald Fulton. Namun, teknik ini kadang-kadang dinamai Wirtz-Conklin setelah dua ahli bakteriologi dari tahun 1900-an.
Indeks artikel
Dasar
Spora tidak ternoda dengan pewarnaan konvensional karena memiliki dinding yang sangat tebal. Komposisi spora yang kompleks mencegah masuknya sebagian besar pewarna.
Jika spora dipelajari dari luar ke dalam, lapisan berikut diamati: pertama, ada eksosporium, yang merupakan lapisan tertipis dan terluar yang dibentuk oleh glikoprotein.
Berikutnya adalah kutikula, yang memberikan ketahanan terhadap suhu tinggi, diikuti oleh korteks yang terdiri dari peptidoglikan. Lalu ada dinding dasar yang melindungi protoplas.
Spora adalah struktur dehidrasi yang mengandung 15% kalsium dan asam dipikolinat. Untuk alasan ini, sebagian besar teknik pewarnaan spora mengandalkan aplikasi panas sehingga pewarna dapat menembus struktur yang tebal.
Setelah spora diwarnai, ia tidak dapat menghilangkan pewarna. Dalam teknik Shaeffer – Fulton, perunggu hijau memasuki sel vegetatif dan, ketika panas diterapkan, menembus endospora serta eksospora.
Dengan mencuci dengan air, pewarna dihilangkan dari sel vegetatif. Hal ini terjadi karena zat warna hijau malakit bersifat sedikit basa, sehingga berikatan lemah dengan sel vegetatif.
Di sisi lain, tidak bisa keluar dari spora dan akhirnya basil dilawan dengan safranin. Fondasi ini berlaku untuk teknik lainnya, di mana hal serupa terjadi.
Teknik pewarnaan spora
Untuk melakukan pewarnaan spora, kultur murni dari strain yang mencurigakan untuk dipelajari harus diperoleh.
Kultur mengalami suhu ekstrim selama 24 jam untuk merangsang mikroorganisme untuk bersporulasi. Untuk ini, kultur dapat ditempatkan dalam oven pada suhu 44 ° C atau di lemari es (8 ° C) selama 24 atau 48 jam.
Jika dibiarkan terlalu lama pada suhu yang disebutkan, hanya eksospora yang akan diamati, karena semua endospora sudah keluar dari basil.
Pada akhir waktu, beberapa tetes larutan fisiologis steril harus ditempatkan pada slide yang bersih. Kemudian sebagian kecil dari kultur diambil dan olesan halus dibuat.
Selanjutnya, dibiarkan kering, dipanaskan dan diwarnai dengan salah satu teknik yang dijelaskan di bawah ini:
Teknik Dorner
1- Siapkan suspensi pekat dari mikroorganisme bersporulasi dalam air suling dalam tabung reaksi dan tambahkan volume yang sama dari Kinyoun carbol fuchsin yang disaring.
2- Tempatkan tabung dalam penangas air mendidih selama antara 5 dan 10 menit.
3- Pada kaca objek yang bersih, campurkan setetes suspensi sebelumnya dengan setetes larutan encer nigrosine 10%, didihkan dan saring.
4- Sebarkan dan keringkan dengan cepat dengan api kecil.
5- Periksa dengan objektif 100X (perendaman).
Spora berwarna merah dan sel bakteri tampak hampir tidak berwarna dengan latar belakang abu-abu gelap.
Teknik Dorner yang Dimodifikasi
1- Suspensi mikroorganisme bersporulasi disebarkan pada kaca objek dan difiksasi dalam panas.
2- Sampel ditutup dengan strip kertas saring yang ditambahkan karbol fuchsin. Pewarna dipanaskan selama 5 sampai 7 menit dengan api pembakar Bunsen sampai evolusi uap dihasilkan. Kemudian kertas dikeluarkan.
3- Sediaan dicuci dengan air dan kemudian dikeringkan dengan kertas penyerap.
4- Apusan ditutup dengan film tipis 10% nigrosin, menggunakan slide kedua untuk menyebarkan nigrosin atau jarum.
Pewarnaan yang diambil oleh spora dan bakteri adalah sama seperti yang dijelaskan dalam penemuan sebelumnya.
Shaeffer – teknik Fulton atau Wirtz-Conklin
1- Buat apusan halus dengan suspensi mikroorganisme bersporulasi pada kaca objek dan fiksasi hingga panas.
2- Tutup kaca objek dengan larutan air 5% malachite green (kertas saring dapat ditempatkan pada kaca objek).
3- Panaskan di atas nyala api pembakar Bunsen agar uapnya keluar dan nyalanya hilang. Ulangi operasi selama 6 hingga 10 menit. Jika larutan hijau perunggu menguap terlalu banyak selama prosedur, lebih banyak dapat ditambahkan.
4- Lepaskan kertas saring (jika terpasang) dan cuci dengan air.
5- Tutup slide dengan safranin berair 0,5% selama 30 detik (beberapa varian teknik menggunakan safranin berair 0,1% dan biarkan selama 3 menit).
Dengan teknik ini, spora tampak hijau dan basil berwarna merah.
Kerugiannya adalah endospora kultur muda tidak terwarnai dengan baik, karena tampak sangat jernih atau tidak berwarna. Untuk menghindari hal ini, dianjurkan untuk menggunakan kultur inkubasi 48 jam.
Teknik Moeller
1- Tutup apusan dengan kloroform selama 2 menit.
2- Buang kloroform.
3- Tutup dengan asam kromat 5% selama 5 menit.
4- Cuci dengan air suling
5- Lembaran ditutupi dengan karbol fuchsin-fenicada dan terkena api pembakar Bunsen sampai emisi uap; kemudian diangkat dari api selama beberapa saat. Operasi diulang sampai 10 menit selesai.
6- Cuci dengan air.
7- Gunakan etanol yang diasamkan (alkohol klorida) untuk menghitamkan. Itu dibiarkan selama 20 atau 30 detik.
8- Cuci dengan air suling.
9- Kontraskan dengan menutupi lembaran dengan metilen biru selama 5 menit.
10- Cuci dengan air suling.
11- Biarkan kering dan bawa sampel ke mikroskop.
Spora tampak merah dan basil berwarna biru. Penting untuk tidak menghirup uapnya, karena mereka beracun dan dapat menjadi karsinogenik dalam jangka panjang.
Teknik Möeller Modifikasi Tanpa Panas
Pada tahun 2007 Hayama dan rekan-rekannya membuat modifikasi dari teknik Möeller. Mereka menghilangkan tahap pemanasan zat warna dan menggantinya dengan penambahan 2 tetes surfaktan Tergitol 7 untuk setiap 10 ml larutan karbol fuchsin-karbol. Hasil yang sama diperoleh.
Kegunaan
Pewarnaan spora memberikan informasi yang sangat berharga dan berguna untuk identifikasi patogen, karena keberadaannya, bentuknya, lokasinya di dalam basil dan kemampuan untuk merusak sel vegetatif atau tidak, adalah data yang dapat memandu spesies. genre tertentu.
Dalam konteks ini, perlu dikatakan bahwa spora dapat berbentuk bulat atau oval, dapat terletak di tengah atau juga dalam posisi parasentral, subminal atau terminal.
Diagram bentuk dan posisi endospora dan eksospora
Contoh
– Clostridium difficile membentuk spora oval dalam posisi terminal yang merusak basil.
– Spora Clostridium tertium berbentuk oval, tidak merusak basil dan terletak di tingkat terminal.
– Endospora Clostridium tetani adalah terminal dan merusak basil, memberikan penampilan stik drum.
– Spora Clostridium botulinum , C. histolyticum , C. novy dan C. septicum berbentuk bulat atau oval subterminal dan merusak bentuk basil.
– Endospora Clostridium sordelli terletak di posisi tengah, dengan sedikit deformasi.
Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosa Mikrobiologi. (edisi ke-5). Argentina, Editorial Panamericana SA
Referensi
- Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakita Y. Proposal teknik yang disederhanakan untuk pewarnaan spora bakteri tanpa menerapkan panas – modifikasi metode Moeller yang berhasil. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
- Kontributor Wikipedia. noda Moeller. Wikipedia, ensiklopedia gratis. 3 November 2018, 03:28 UTC. Tersedia di: en.wikipedia.org
- Perez R, Juarez M, Rodríguez (2011). Manual Laboratorium Teknik Mikrobiologi. Jurusan Ilmu Dasar Akademi Mikrobiologi. Institut Politeknik Nasional.
- “Endospora.” Wikipedia, Ensiklopedia Bebas . 25 Februari 2018, 10:20 UTC. 10 Jan 2019, 02:42: en.wikipedia.org
- Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J dan kolaborator. (2006). Personil Buruh dari komunitas otonom Extremadura. Agenda Khusus Jilid IV. Redaksi MAD. Sevilla-Spanyol, hal 211-212.
- Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006) Teknisi spesialis laboratorium, Layanan Kesehatan Galicia (SERGAS). Agenda mata pelajaran khusus volume 2. Editorial MAD. Sevilla-Spanyol, hal 79-80.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnosa Mikrobiologi. (edisi ke-5). Argentina, Editorial Panamericana SA
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnosis Mikrobiologi Bailey & Scott. 12 edisi Argentina. Editorial Panamericana SA
