Pewarnaan Giemsa: alasan, bahan, teknik, dan kegunaan

Giemsa stain adalah jenis pewarnaan sampel klinis, berdasarkan campuran pewarna asam dan dasar. Penciptaannya terinspirasi oleh pekerjaan yang dilakukan oleh Romanowsky, di mana Gustav Giemsa, seorang ahli kimia dan bakteriologi dari Jerman, menyempurnakannya dengan menambahkan gliserol untuk menstabilkan senyawa.

Perubahan yang dihasilkan pada teknik Romanowsky asli memungkinkan untuk meningkatkan pengamatan mikroskopis secara signifikan, oleh karena itu teknik ini dibaptis dengan nama pewarnaan Giemsa.

Berbagai sampel diwarnai dengan pewarnaan Giemsa. A. Trypanosoma evansi dalam darah tepi. B.Sel darah normal. C. Borrelia theileri dalam darah tepi. D. Limfoma Burkitt.

Karena merupakan teknik yang sederhana untuk dilakukan, sangat fungsional dan ekonomis, saat ini banyak digunakan di laboratorium klinis untuk apusan hematologi, sampel sumsum tulang, dan potongan jaringan.

Teknik pewarnaan Giemsa sangat berguna untuk studi sitologi, karena memungkinkan pengamatan struktur sel tertentu. Teknik ini mewarnai sitoplasma, inti, nukleolus, vakuola dan butiran sel, mampu membedakan jejak kromatin yang halus sekalipun.

Selain itu, perubahan signifikan dalam ukuran, bentuk atau warna nukleus dapat dideteksi, di mana dimungkinkan untuk memvisualisasikan hilangnya hubungan nukleus-sitoplasma.

Di sisi lain, memungkinkan identifikasi sel yang belum matang di sumsum tulang dan darah tepi, yang penting untuk diagnosis penyakit serius seperti leukemia. Dimungkinkan juga untuk mendeteksi hemoparasit, bakteri ekstra dan intraseluler, jamur, dan lainnya.

Dalam sitogenetika ini banyak digunakan, karena dimungkinkan untuk mempelajari mitosis sel.

Indeks artikel

Dasar pewarnaan Giemsa

Pewarna jenis Romanowsky didasarkan pada penggunaan kontras antara pewarna asam dan basa, untuk mencapai pewarnaan struktur basa dan asam masing-masing. Seperti dapat dilihat, ada afinitas pewarna asam untuk mewarnai struktur dasar dan sebaliknya.

Pewarna dasar yang digunakan adalah metilen biru dan turunannya yang teroksidasi (Azure A dan Azure B), sedangkan pewarna asam adalah eosin.

Struktur asam sel adalah asam nukleat, butiran basofil tersegmentasi, antara lain, oleh karena itu mereka akan diwarnai dengan metilen biru.

Dalam pengertian ini, struktur dasar sel adalah hemoglobin dan beberapa butiran seperti yang terkandung dalam eosinofil tersegmentasi, antara lain; ini akan diwarnai dengan eosin.

Di sisi lain, karena metilen biru dan biru dicirikan sebagai pewarna metakromatik, mereka dapat memberikan warna variabel untuk struktur yang berbeda sesuai dengan beban polianion yang mereka miliki.

Ini adalah bagaimana kombinasi strategis pewarna basa dan asam berhasil mengembangkan spektrum warna yang luas, sesuai dengan karakteristik biokimia setiap struktur, berjalan melalui nada biru pucat, biru tua, ungu muda dan ungu dalam kasus struktur asam.

Sedangkan pewarnaan yang diberikan oleh eosin lebih stabil, menghasilkan warna antara jingga kemerahan dan salmon.

bahan

Bahan untuk menyiapkan larutan stok

Persiapan larutan stok membutuhkan 600 mg pewarna Giemsa bubuk, mengukur 500 cc metil alkohol bebas aseton dan 50 cc gliserin netral.

Bagaimana menyiapkan larutan stok?

Tempatkan bubuk Giemsa yang berat dalam mortar. Jika ada gumpalan, mereka harus disemprotkan. Selanjutnya tambahkan sejumlah besar gliserin terukur dan aduk rata. Campuran yang diperoleh dituangkan ke dalam botol amber yang sangat bersih.

Sisa gliserin ditempatkan di mortar. Campur lagi untuk membersihkan sisa pewarna yang menempel di dinding mortar dan tambahkan ke toples yang sama.

Botol ditutup dan disimpan selama 2 jam dalam penangas air pada suhu 55ºC. Saat berada di penangas air, kocok perlahan campuran setiap setengah jam atau lebih.

Selanjutnya, campuran dibiarkan dingin untuk menempatkan alkohol. Sebelumnya, sebagian dari alkohol yang diukur ditempatkan dalam mortar untuk menyelesaikan pencucian sisa pewarna dan kemudian ditambahkan ke dalam campuran bersama dengan sisa alkohol.

Persiapan ini harus dibiarkan matang selama minimal 2 minggu. Bagian yang digunakan dari larutan stok harus disaring.

Untuk menghindari kontaminasi pada sediaan, disarankan untuk memindahkan bagian yang akan terus digunakan ke botol kuning kecil dengan penetes. Isi ulang setiap kali reagen habis.

Bahan untuk menyiapkan larutan Buffer

Di sisi lain, larutan buffer pada pH 7,2 disiapkan sebagai berikut:

6,77 g natrium fosfat (anhidrat) (NaHPO 4 ), 2,59 g kalium dihidrogen fosfat (KH 2 PO 4 ) dan air suling ditimbang hingga 1000 cc.

Persiapan akhir pewarna

Untuk pembuatan larutan pewarnaan akhir, diukur 2 ml larutan stok tersaring dan dicampur dengan 6 ml larutan buffer. Campuran diaduk.

Fakta relevan yang harus diperhitungkan adalah bahwa teknik persiapan pewarnaan dapat berubah tergantung pada rumah komersial.

Bahan tambahan yang dibutuhkan untuk melakukan pewarnaan

Selain bahan-bahan yang dijelaskan, Anda harus memiliki jembatan pewarna, kaos dengan air atau penyangga untuk mencuci, slide objek atau penutup untuk objek, pengatur waktu untuk mengontrol waktu pewarnaan dan kertas isap atau beberapa bahan yang dapat digunakan untuk mengeringkan ( kasa atau kapas).

Teknik

Proses pewarnaan

1) Sebelum pewarnaan, apusan sampel harus siap pada slide yang bersih.

Sampel dapat berupa darah, sumsum tulang, bagian jaringan histologis atau sampel serviks-vagina. Disarankan agar olesannya tipis dan dikeringkan selama 1 atau 2 jam sebelum diwarnai.

2) Pada jembatan pewarnaan, letakkan semua lembaran yang harus diwarnai. Anda selalu bekerja dalam urutan yang sama dan setiap lembar diidentifikasi dengan baik.

3) Tempatkan beberapa tetes 100% metil alkohol (metanol) pada apusan dan biarkan selama 3 sampai 5 menit, untuk memperbaiki dan mengeringkan sampel.

4) Buang metanol yang ada dalam lembaran dan biarkan mengering.

5) Setelah kering, tempatkan larutan pewarnaan terakhir dengan pipet sampai seluruh lembaran tertutup. Biarkan untuk bertindak selama 15 menit. Beberapa penulis merekomendasikan hingga 25 menit. Itu tergantung pada rumah bisnis.

6) Tiriskan noda dan cuci apusan dengan air suling atau dengan larutan buffer 7,2.

7) Di atas kertas isap, biarkan lembaran mengering di udara terbuka, disusun secara vertikal dengan bantuan penyangga.

8) Bersihkan bagian belakang slide dengan kain kasa atau kapas yang dibasahi dengan alkohol untuk menghilangkan noda.

Keperluan

Teknik pewarnaan Giemsa digunakan di berbagai bidang, termasuk: hematologi, mikologi, bakteriologi, parasitologi, sitologi, dan sitogenetika.

Hematologi

Ini adalah penggunaan yang paling sering diberikan pada noda ini. Dengan itu, setiap sel yang ada dalam sumsum tulang atau sampel darah tepi dapat diidentifikasi. Serta memperkirakan jumlah setiap seri, mampu mendeteksi leukositosis atau leukopenia, trombositopenia, dll.

Karena sensitif dalam mengidentifikasi sel yang belum matang, ini relevan dalam diagnosis leukemia akut atau kronis. Hal ini juga memungkinkan untuk membuat diagnosis anemia, seperti anemia sel sabit, sel sabit, antara lain.

Ilmu jamur

Di daerah ini, penggunaannya umum untuk mencari Histoplasma capsulatum (jamur dimorfik intraseluler) dalam sampel jaringan.

Bakteriologi

Pada apusan hematologi yang diwarnai dengan Giemsa, Borrelias sp dapat dideteksi pada pasien yang datang dengan penyakit yang disebut demam berulang. Spirochetes berlimpah di antara eritrosit, dalam sampel yang diambil pada puncak demam.

Hal ini juga memungkinkan untuk memvisualisasikan bakteri intraseluler seperti Rickettsia sp dan Chlamydia trachomatis dalam sel yang terinfeksi.

parasitologi

Di bidang parasitologi, pewarnaan Giemsa telah memungkinkan untuk mendiagnosis penyakit parasit seperti malaria, penyakit Chagas dan leishmaniasis.

Dalam dua yang pertama parasit Plasmodium sp dan Trypanosoma cruzi masing-masing dapat dilihat di darah tepi pasien yang terinfeksi, mereka dapat ditemukan dalam berbagai tahap tergantung pada stadium penyakit.

Untuk meningkatkan pencarian parasit dalam darah, disarankan untuk menggunakan pewarna Giemsa yang dicampur dengan pewarna May-Grünwald.

Demikian juga, leishmaniasis kulit dapat didiagnosis dengan mengevaluasi sampel biopsi kulit yang diwarnai dengan Giemsa di mana parasit ditemukan.

Sitologi

Pewarnaan Giemsa juga digunakan untuk studi sitologi sampel endoserviks, meskipun bukan teknik yang paling sering digunakan untuk tujuan ini.

Tetapi dalam kasus sumber daya yang langka dapat digunakan, memiliki fungsi yang serupa dengan yang ditawarkan oleh teknik Papanicolaou dan dengan biaya yang lebih rendah. Namun, hal itu membutuhkan keahlian dari pihak pemeriksa.

Sitogenetika

Fitur pewarnaan Giemsa yang relevan adalah kemampuannya untuk mengikat kuat pada daerah DNA yang kaya adenin dan timin . Hal ini memungkinkan DNA untuk divisualisasikan selama mitosis sel, dalam keadaan kondensasi yang berbeda.

Studi-studi ini diperlukan untuk mendeteksi aberasi kromatik seperti duplikasi, penghapusan, atau translokasi dari berbagai daerah kromosom.

Penelitian yang Mendemonstrasikan Khasiat Pewarnaan Giemsa

Cannova et al (2016), membandingkan 3 teknik pewarnaan untuk diagnosis leishmaniasis kulit.

Untuk ini, mereka menggunakan sampel yang diperoleh dari hewan percobaan ( Mesocrisetus auratus) yang diinokulasi secara eksperimental dengan Leishmanias.

Penulis menunjukkan bahwa pewarnaan Giemsa lebih baik daripada pewarnaan Pap-mart® dan Gaffney. Oleh karena itu, mereka menganggap pewarnaan Giemsa ideal untuk mendiagnosis leishmaniasis kulit.

Hasil yang sangat baik yang diperoleh oleh penulis adalah karena fakta bahwa kombinasi pewarna yang membentuk campuran Giemsa menyajikan kondisi yang diperlukan untuk menciptakan kontras yang menguntungkan, memungkinkan struktur amastigot dibedakan dengan jelas, baik secara intraseluler maupun ekstraseluler.

Teknik lain (Pap-mart® dan Gaffney) juga melakukannya, tetapi dengan cara yang lebih lemah dan karena itu lebih sulit untuk divisualisasikan. Itulah sebabnya pewarnaan Giemsa direkomendasikan untuk diagnosis parasitologis leishmaniasis.

Demikian juga, sebuah studi oleh Ramírez et al (1994) mengevaluasi validitas pewarnaan Giemsa dan Lendrum pada apusan konjungtiva untuk identifikasi Chlamydia trachomatis.

Penulis menentukan bahwa pewarnaan Giemsa dan Ledrum memiliki spesifisitas yang sama, tetapi Giemsa ditemukan lebih sensitif.

Ini menjelaskan mengapa pewarnaan Giemsa saat ini paling sering digunakan untuk diagnosis infeksi klamidia, terutama jika sumber dayanya sedikit.

Sumber: Reagen ITW Applichem PanReac. noda Giemsa. Versi 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Valles, Spanyol.

Rekomendasi untuk pewarnaan yang baik

Pengeringan lembaran tidak boleh dipercepat. Anda harus menunggu waktu yang wajar untuk mengeringkannya di udara terbuka. Kurang lebih 2 jam.

Warnai segera setelah 2 jam untuk hasil terbaik.

Untuk apusan untuk memperbaiki dan mewarnai lebih baik, sampel harus didistribusikan pada slide sedemikian rupa sehingga lapisan tipis dan seragam tetap.

Sampel darah yang disukai adalah kapiler, karena apusan dibuat langsung dari tetesan darah dan oleh karena itu sampel tidak mengandung aditif apa pun, yang mendukung pemeliharaan struktur seluler.

Namun, jika darah vena digunakan, EDTA harus digunakan sebagai antikoagulan dan bukan heparin, karena heparin biasanya merusak sel.

Kesalahan umum dalam pewarnaan Giemsa

Dalam praktek pewarnaan ini kesalahan dapat dilakukan. Mereka dibuktikan dengan perubahan mendadak dalam nada struktur.

Pewarnaan yang sangat biru

Ini mungkin karena:

  • Kotoran yang sangat tebal
  • Melebihi waktu pewarnaan
  • Cuci tidak cukup.
  • Penggunaan reagen jauh di atas pH netral (basa).

Di bawah kondisi ini warna struktur berikut terdistorsi, sedemikian rupa sehingga eritrosit bukannya pewarnaan salmon-pink akan tampak hijau, butiran eosinofil yang harus diwarnai merah bata akan berubah menjadi kebiruan atau abu-abu dan seterusnya akan ada menjadi penyimpangan dalam nada biasa.

Warna merah jambu yang berlebihan

Ini mungkin karena:

  • Waktu pewarnaan tidak mencukupi.
  • Pencucian yang terlalu lama atau berlebihan.
  • Pengeringan yang buruk.
  • Penggunaan reagen yang sangat asam.

Dalam kasus khusus ini, struktur yang biasanya bernoda biru hampir tidak akan terlihat, sedangkan struktur yang bernoda merah muda akan memiliki rona yang sangat berlebihan.

Contoh: Eritrosit akan berubah menjadi merah terang atau jingga kuat, kromatin inti akan tampak merah muda pucat, dan butiran eosinofil akan berwarna merah tua terang.

Kehadiran presipitat dalam smear

Penyebabnya bisa:

  • Menggunakan film yang kotor atau tidak dicuci dengan baik.
  • Jangan biarkan apusan mengering dengan baik.
  • Membiarkan larutan pengikat terlalu lama.
  • Pencucian yang tidak memadai pada akhir pewarnaan.
  • Filtrasi yang tidak memadai atau tidak ada penyaringan pewarna yang digunakan.

Kehadiran artefak morfologis

Artefak morfologis dapat muncul dalam apusan, sehingga sulit untuk memvisualisasikan dan menafsirkan struktur yang ada. Ini berhubungan dengan:

  • Jenis antikoagulan yang digunakan, seperti heparin.
  • Penggunaan film kotor, rusak atau berminyak.

Mode penyimpanan

Setelah persiapan, pewarna harus disimpan pada suhu kamar (15 – 25 ° C), untuk mencegah pewarna mengendap. Itu harus disimpan dalam wadah kuning tertutup rapat.

Referensi

  1. Cannova D, Brito E dan Simons M. Evaluasi teknik pewarnaan untuk diagnosis Leishmaniasis kulit. Salus . 2016; 20 (2): 24-29.
  2. Reagen ITW Applichem PanReac . noda Giemsa. Versi 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Valles, Spanyol.
  3. Prosedur pewarnaan Clark G. (1981), 4thed. Williams & Willkins.
  4. Kimia Klinis Terapan. Pewarnaan Giemsa untuk diagnostik in vitro . Distributor: cromakit.es
  5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F dan Grazioso C. Validitas pewarnaan Giemsa dan Lendrum pada apusan konjungtiva untuk identifikasi Chlamydia trachomatis. Bol dari Sanit Panama. 1994; 116 (3): 212-216.
  6. Casas-Rincón G. Mikologi Umum. 1994. Edisi ke-2 Universitas Pusat Venezuela, Edisi Perpustakaan. Venezuela Caracas.
  7. “Noda Giemsa.” Wikipedia, Ensiklopedia Bebas . 1 Sep 2017, 01:02 UTC. 6 Desember 2018, es.wikipedia.org.