Apa yang dimaksud dengan Sekuensing DNA

Pengertian Sekuensing DNA

Sekuensing DNA adalah proses penentuan urutan nukleotida dalam molekul DNA. DNA setiap organisme terdiri dari urutan nukleotida yang unik. Menentukan urutan dapat membantu para ilmuwan membandingkan DNA antara organisme, yang dapat membantu menunjukkan bagaimana organisme tersebut terkait.

Sekilas

Ini berarti bahwa dengan mengurutkan rangkaian DNA, akan mungkin untuk mengetahui urutan empat basa nukleotida – adenin, guanin, sitosin, dan timin – terjadi dalam molekul asam nukleat tersebut.

Perlunya sekuensing DNA pertama kali diperjelas oleh teori Francis Crick bahwa sekuens nukleotida dalam molekul DNA secara langsung memengaruhi sekuens asam amino protein. Pada saat itu, kepercayaannya adalah bahwa genom yang diurutkan sepenuhnya akan mengarah pada lompatan kuantum dalam memahami biokimia sel dan organisme.

Sekuensing DNA modern terdiri dari metode throughput tinggi yang memungkinkan seluruh sekuens DNA ditemukan dalam hitungan jam. Teknologi ini telah memungkinkan banyak perusahaan untuk mulai menawarkan pengujian DNA di rumah. Banyak “hasil” yang ditemukan oleh tes ini hanyalah korelasi yang ditemukan antara varian genetik dan kondisi tertentu. Namun, teknologi juga memungkinkan para ilmuwan menguji DNA banyak organisme untuk lebih memahami hubungan evolusi.

Contoh Sekuensing DNA

Meskipun pengurutan DNA digunakan untuk waktu bertahun-tahun, sekarang dapat dilakukan dalam hitungan jam. Selanjutnya, urutan penuh pertama dari DNA manusia memakan waktu sekitar 3 miliar dolar. Sekarang, perusahaan tertentu akan mengurutkan seluruh genom Anda dengan harga kurang dari $ 1.000. Tes paling canggih akan menganalisis setiap nukleotida dalam genom Anda. Namun, banyak perusahaan sekarang menawarkan tes polimorfisme nukleotida tunggal.

Tes-tes ini fokus pada nukleotida individu dalam gen yang dapat menandakan varian genetik tertentu. SNP ini, sebagaimana diketahui, telah dikorelasikan dengan kondisi tertentu dan dapat membantu memprediksi bagaimana gen Anda dapat memengaruhi kehidupan Anda. Beberapa SNP terkait dengan berbagai penyakit, sementara yang lain terkait dengan metabolisme Anda dan bagaimana tubuh Anda memproses nutrisi. Ribuan korelasi berbeda telah ditemukan, dan sekuensing DNA dapat digunakan untuk mencari tahu bagaimana genom Anda memengaruhi hidup Anda.

Metode Sekuensing DNA

Ada dua jenis utama pengurutan DNA. Metode terminasi rantai yang lebih tua dan klasik juga disebut metode Sanger. Metode baru yang dapat memproses sejumlah besar molekul DNA dengan cepat secara kolektif disebut teknik High-Throughput Sekuensing (HTS) atau metode Next-Generation Sekuensing (NGS).

Sanger Sekuensing

Metode Sanger bergantung pada primer yang berikatan dengan molekul DNA terdenaturasi dan memulai sintesis polinukleotida beruntai tunggal di hadapan enzim DNA polimerase, menggunakan DNA terdenaturasi sebagai templat. Dalam sebagian besar keadaan, enzim mengkatalisis penambahan nukleotida. Ikatan kovalen, oleh karena itu, terbentuk antara 3 ′ atom karbon molekul gula deoksiribosa dalam satu nukleotida dan 5 ′ atom karbon berikutnya. Gambar di bawah ini menunjukkan bagaimana ikatan ini terbentuk.

Namun, campuran reaksi sekuensing akan memiliki proporsi kecil nukleotida termodifikasi yang tidak dapat membentuk ikatan kovalen ini karena tidak adanya gugus hidroksil reaktif, sehingga menimbulkan istilah ‘dideoksiribonukleotida’, yaitu, mereka tidak memiliki 2 ‘atau Atom oksigen 3 ‘bila dibandingkan dengan ribonukleotida yang sesuai. Ini akan menghentikan reaksi polimerisasi DNA sebelum waktunya. Pada akhir beberapa putaran polimerisasi tersebut, campuran molekul dengan panjang yang bervariasi akan dibuat.

Dalam upaya paling awal menggunakan metode Sanger, molekul DNA pertama-tama diamplifikasi menggunakan primer berlabel dan kemudian dipecah menjadi empat tabung reaksi, masing-masing hanya memiliki satu jenis ddNTP. Artinya, setiap campuran reaksi hanya akan memiliki satu jenis nukleotida termodifikasi yang dapat menyebabkan pemutusan rantai. Setelah empat reaksi selesai, campuran molekul DNA yang diciptakan oleh pemutusan rantai akan menjalani elektroforesis pada gel poliakrilamida, dan dipisahkan menurut panjangnya.

Pada gambar di atas, reaksi sekuensing dengan ddATP dielektroforesis melalui kolom pertama. Setiap baris mewakili molekul DNA dengan panjang tertentu, hasil dari reaksi polimerisasi yang diakhiri dengan penambahan nukleotida ddATP. Kolom kedua, ketiga dan keempat masing-masing berisi ddTTP, ddGTP, dan ddCTP.

Seiring waktu, metode ini dimodifikasi sehingga setiap ddNTP memiliki label fluorescent yang berbeda. Primer tidak lagi menjadi sumber radiolabel atau tag fluorescent. Juga dikenal sebagai pewarna terminator, metode ini menggunakan empat pewarna dengan spektrum emisi yang tidak tumpang tindih, satu untuk setiap ddNTP.

Gambar menunjukkan perbedaan antara primer berlabel, dNTP berlabel dan NTP terminator dicelup.

Gambar di atas menunjukkan representasi skematis dari urutan pewarna-terminator. Ada campuran reaksi tunggal yang membawa semua elemen yang dibutuhkan untuk pemanjangan DNA. Campuran reaksi juga mengandung konsentrasi kecil empat ddNTP, masing-masing dengan tag fluorescent yang berbeda. Reaksi selesai dijalankan pada gel kapiler. Hasilnya diperoleh melalui analisis spektrum emisi dari setiap pita DNA pada gel. Suatu program perangkat lunak kemudian menganalisis spektra dan menyajikan urutan molekul DNA.

Sekuensing Throughput Tinggi

Sanger sekuensing terus berguna untuk menentukan urutan rentangan DNA yang relatif panjang, terutama pada volume rendah. Namun, itu bisa menjadi mahal dan melelahkan ketika sejumlah besar molekul perlu diurutkan dengan cepat. Ironisnya, meskipun metode pewarna-terminator tradisional berguna ketika molekul DNA lebih panjang, metode throughput tinggi telah menjadi lebih banyak digunakan, terutama ketika seluruh genom perlu diurutkan.

Ada tiga perubahan besar dibandingkan dengan metode Sanger. Yang pertama adalah pengembangan sistem bebas sel untuk mengkloning fragmen DNA. Secara tradisional, bentangan DNA yang perlu disekuensing pertama-tama dikloning menjadi plasmid prokariotik dan diamplifikasi dalam bakteri sebelum diekstraksi dan dimurnikan. Teknologi sekuensing throughput tinggi atau generasi berikutnya tidak lagi bergantung pada prosedur padat karya dan intensif waktu ini.

Kedua, metode ini menciptakan ruang untuk menjalankan jutaan reaksi sekuensing secara paralel. Ini adalah langkah besar ke depan dari metode awal di mana delapan campuran reaksi yang berbeda diperlukan untuk menghasilkan urutan nukleotida tunggal yang dapat diandalkan. Akhirnya, tidak ada pemisahan antara langkah perpanjangan dan deteksi. Basa diidentifikasi sebagai hasil reaksi sekuensing. Sementara HTS mengurangi biaya dan waktu, ‘pembacaan’ mereka relatif singkat. Artinya, untuk menyusun seluruh genom, perhitungan yang intens diperlukan.

Munculnya HTS telah memperluas aplikasi untuk genomik. Sekuensing DNA kini telah menjadi bagian integral dari ilmu dasar, penelitian translasi, diagnostik medis, dan forensik.

Penggunaan Sekuensing DNA

Teknologi tradisional, terminasi-rantai dan metode HTS digunakan untuk berbagai aplikasi saat ini. Sekuensing sanger sekarang banyak digunakan untuk sekuensing awal molekul DNA untuk mendapatkan data sekuens primer untuk suatu organisme atau gen. ‘Pembacaan’ yang relatif singkat berasal dari reaksi HTS (30-400 pasangan basa dibandingkan dengan hampir seribu pasangan basa ‘dibaca’ dari metode pengurutan Sanger) menyulitkan untuk membuat seluruh genom suatu organisme dari metode HTS saja. Kadang-kadang, pengurutan Sanger juga diperlukan untuk memvalidasi hasil HTS.

Di sisi lain, HTS memungkinkan penggunaan sekuensing DNA untuk memahami polimorfisme nukleotida tunggal – di antara jenis variasi genetik yang paling umum dalam suatu populasi. Ini menjadi penting dalam biologi evolusioner serta dalam pendeteksian gen-gen bermutasi yang dapat menyebabkan penyakit. Misalnya, variasi urutan dalam sampel dari adenokarsinoma paru memungkinkan deteksi mutasi langka yang terkait dengan penyakit. Situs pengikatan kromatin untuk protein nuklir spesifik juga dapat diidentifikasi secara akurat menggunakan metode ini

Secara keseluruhan, sekuensing DNA menjadi bagian integral dari banyak aplikasi yang berbeda.

Diagnostik

Sekuensing genom sangat berguna untuk mengidentifikasi penyebab kelainan genetik langka. Sementara lebih dari 7800 penyakit dikaitkan dengan pola pewarisan Mendel, kurang dari 4000 penyakit tersebut secara definitif terkait dengan gen atau mutasi tertentu. Analisis awal exon-genome, atau exome, yang terdiri dari semua gen yang diekspresikan dari suatu organisme, menunjukkan janji dalam mengidentifikasi alel penyebab untuk banyak penyakit yang diturunkan. Dalam satu kasus tertentu, pengurutan genom seorang anak yang menderita bentuk parah penyakit radang usus menghubungkan penyakit tersebut dengan mutasi pada gen yang terkait dengan peradangan – XIAP. Sementara pasien awalnya menunjukkan beberapa gejala yang menunjukkan defisiensi imun, transplantasi sumsum tulang direkomendasikan berdasarkan hasil urutan DNA. Anak itu kemudian sembuh dari penyakitnya.

Selain itu, HTS telah menjadi pemain penting dalam mengembangkan pemahaman yang lebih besar tentang tumor dan kanker. Memahami dasar genetik tumor atau kanker memungkinkan dokter untuk memiliki alat tambahan dalam kit mereka untuk membuat keputusan diagnostik. Atlas Genom Kanker dan Konsorsium Genom Kanker Internasional telah mengurutkan sejumlah besar tumor dan menunjukkan bahwa pertumbuhan ini dapat sangat bervariasi dalam hal lanskap mutasi mereka. Ini juga memberikan pemahaman yang lebih baik tentang jenis pilihan perawatan yang ideal untuk setiap pasien. Misalnya, sekuensing genom kanker payudara mengidentifikasi dua gen – BRCA1 dan BRCA2 – yang varian patogeniknya memiliki dampak besar pada kemungkinan mengembangkan kanker payudara. Orang dengan beberapa alel patogen bahkan memilih untuk menjalani operasi pencegahan seperti mastektomi ganda.

Biologi Molekuler

Pengurutan DNA sekarang menjadi bagian integral dari sebagian besar laboratorium biologi. Ini digunakan untuk memverifikasi hasil latihan kloning untuk memahami efek gen tertentu. Teknologi HTS digunakan untuk mempelajari variasi dalam komposisi genetik plasmid, bakteri, ragi, nematoda atau bahkan mamalia yang digunakan dalam percobaan laboratorium. Misalnya, garis sel yang berasal dari jaringan kanker payudara, yang disebut HeLa, digunakan di banyak laboratorium di seluruh dunia dan sebelumnya dianggap sebagai garis sel yang dapat diandalkan yang mewakili jaringan payudara manusia. Hasil sekuensing terbaru telah menunjukkan variasi besar dalam genom sel HeLa dari sumber yang berbeda, sehingga mengurangi kegunaannya dalam biologi sel dan molekuler.

Pengurutan DNA memberikan wawasan tentang elemen pengatur dalam genom setiap sel, dan variasi dalam aktivitasnya dalam berbagai tipe sel dan individu. Sebagai contoh, gen tertentu dapat dimatikan secara permanen di beberapa jaringan, sementara secara konstitutif dinyatakan dalam yang lain. Demikian pula, mereka yang rentan terhadap penyakit tertentu dapat mengatur gen secara berbeda dari mereka yang kebal. Perbedaan-perbedaan ini di daerah pengaturan DNA dapat ditunjukkan melalui pengurutan dan dapat memberikan wawasan tentang dasar untuk fenotipe.

Kemajuan terbaru bahkan telah memungkinkan laboratorium individu untuk mempelajari variasi struktural dalam genom manusia – suatu usaha yang membutuhkan kolaborasi global dua dekade lalu.

Forensik

Kemampuan untuk menggunakan konsentrasi DNA yang rendah untuk mendapatkan pembacaan sekuensing yang andal telah sangat berguna bagi ilmuwan forensik. Secara khusus, potensi untuk mengurutkan setiap DNA dalam sampel menarik, terutama karena tempat kejadian kejahatan sering mengandung materi genetik dari banyak orang. HTS perlahan-lahan diadopsi di banyak laboratorium forensik untuk identifikasi manusia. Selain itu, kemajuan terbaru memungkinkan para ilmuwan forensik untuk mengurutkan eksom seseorang setelah kematian, terutama untuk menentukan penyebab kematian. Misalnya, kematian karena keracunan akan menunjukkan perubahan pada eksome di organ yang terkena. Di sisi lain, sekuensing DNA juga dapat menentukan bahwa almarhum memiliki penyakit atau kecenderungan genetik yang sudah ada sebelumnya. Tantangan dalam bidang ini mencakup pengembangan perangkat lunak analisis yang sangat andal, terutama karena hasil HTS tidak dapat diperiksa secara manual.

Loading…

Tinggalkan Balasan

Alamat email Anda tidak akan dipublikasikan. Ruas yang wajib ditandai *