smear bakteri adalah ekstensi film tipis dari suspensi mikroorganisme bakteri yang dibuat di atas piring kaca transparan atau slide, untuk pengamatan di bawah mikroskop cahaya.
Perpanjangan dalam bentuk film dilakukan untuk memisahkan mikroorganisme sebanyak mungkin, karena jika dikelompokkan maka pengamatannya tidak jelas.
Gambar 1. Apusan bakteri terlihat di bawah mikroskop elektron. Sumber: pixbay.com
Dalam studi kultur bakteri, teknik preparasi apusan, fiksasi dan pewarnaan digunakan untuk menganalisisnya dengan lebih baik. Karena ukuran mikroorganisme yang kecil, penggunaan mikroskop optik diperlukan untuk pengamatannya.
Mikroskop optik adalah instrumen yang sangat diperlukan untuk mengamati apusan. Ini menggunakan lensa optik dan cahaya yang memungkinkan visualisasi sampel dengan perbesaran ukuran yang besar.
Secara umum, sel hidup tidak memiliki sebagian besar struktur berwarna, dilihat dengan mikroskop cahaya mereka tidak berwarna, sampel transparan, dan mereka menunjukkan kontras internal yang sangat sedikit dan dengan lingkungannya.
Pengamatan dengan mikroskop cahaya medan terang sederhana, tanpa menggunakan teknik pewarnaan tambahan, sangat terbatas dan hanya digunakan dalam beberapa kasus, seperti pada pengamatan pergerakan mikroorganisme.
Untuk pengamatan mikroorganisme yang optimal, keseimbangan harus dicapai antara kontras dan resolusi. Detail sel tidak dapat dilihat di bawah mikroskop, bahkan dengan resolusi tinggi; penggunaan pewarna diperlukan melalui teknik pewarnaan, yang memberikan kontras untuk pengamatan.
Indeks artikel
Ciri-ciri apusan bakteri yang berkualitas baik
Kontras yang luar biasa
Untuk mencapai kontras yang sangat baik, ada mikroskop canggih yang disebut mikroskop fase kontras, mikroskop interferensi diferensial, dan mikroskop medan gelap . Ini jenis mikroskop digunakan untuk mengamati struktur bakteri seperti sarung dan filamen, antara lain.
Pewarnaan adalah teknik sederhana untuk meningkatkan kontras yang dicapai dengan mikroskop brightfield. Dalam teknik ini, pewarna yang berbeda dapat digunakan yang secara signifikan meningkatkan pengamatan mikroskopis.
Pewarnaan dilakukan langsung pada apusan atau perpanjangan suspensi mikroorganisme pada slide, yang sebelumnya dikeringkan dan difiksasi.
Perbaikan yang bagus
Fiksasi adalah teknik yang digunakan untuk mempertahankan struktur sel; menyebabkan inaktivasi mikroorganisme dan adhesi ke kaca slide. Ada perawatan fiksasi yang berbeda: fiksasi panas dan fiksasi kimia.
Fiksasi panas
Ini adalah metode yang paling banyak digunakan untuk mengamati apusan bakteri. Tekniknya terdiri dari melewatkan suspensi bakteri dari apusan melalui nyala korek api. Teknik ini mampu mempertahankan morfologi eksternal bakteri, tetapi menghancurkan struktur internal mereka.
Fiksasi kimia
Fiksasi kimia menggunakan bahan kimia pengawet seperti formaldehida atau formalin, etanol, dan asam asetat, antara lain. Keuntungan menggunakan bahan pengikat kimia adalah bahwa pelestarian struktur seluler internal mikroorganisme tercapai.
Gambar 2. Apusan darah. Sumber: Bobjgalindo [GFDL (http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html) atau CC BY-SA 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0)], dari Wikimedia Commons
Pewarnaan yang bagus
Prosedur yang paling umum untuk pewarnaan apusan yang sebelumnya dikeringkan dan difiksasi adalah pewarnaan positif atau sederhana, pewarnaan diferensial, dan pewarnaan negatif. Ada juga teknik khusus untuk pewarnaan struktur sel tertentu (kapsul, spora, flagela).
Pewarnaan positif atau pewarnaan sederhana
Pewarnaan positif atau sederhana adalah teknik pewarnaan smear yang paling banyak digunakan. Ini menggunakan pewarna yang memiliki kemampuan untuk mengikat struktur mikroba tertentu, memungkinkan mereka untuk diamati di bawah mikroskop.
Zat warna ini memiliki gugus kromofor (bagian berwarna) dalam struktur kimianya, dengan ikatan rangkap dua dan ikatan tunggal (konjugasi). Ikatan ini pada gilirannya dapat membentuk ikatan ionik atau kovalen dengan beberapa struktur seluler.
Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan positif atau sederhana sebagian besar merupakan turunan kimia anilin (garam organik berwarna).
Di sisi lain, di antara pewarna kita dapat menemukan beberapa dengan pH basa dan yang lain dengan pH asam.
pewarna dasar
Pada zat warna basa, gugus kromofor memiliki muatan listrik positif. Sebagian besar mikroorganisme prokariotik memiliki pH internal netral, dan permukaan selnya bermuatan negatif. Melalui interaksi elektrostatik ini, kromofor mengikat sel dan menodainya.
Contoh pewarna dasar antara lain biru metilen, violet kristal, hijau perunggu, fusin dasar, safranin, dan lain-lain.
pewarna asam
Dalam pewarna asam, gugus kromofor memiliki muatan listrik negatif. Ini digunakan untuk mewarnai protein dengan gugus amino bermuatan positif. Contoh pewarna asam adalah asam fuscin, rose bengal, congo red, dan eosin.
Pewarnaan diferensial
Teknik pewarnaan diferensial terdiri dari penerapan dua pewarna dengan warna atau intensitas yang berbeda, untuk membedakan mikroorganisme yang berbeda di bawah mikroskop. pewarnaan Gram dan tahan asam-alkohol noda adalah noda diferensial yang paling umum digunakan dalam bakteriologi.
Pewarnaan Gram digunakan sebagai uji pendahuluan untuk mengetahui bentuk, ukuran, pengelompokan sel, serta jenis dinding sel . Dengan menggunakan uji pewarnaan Gram, bakteri dinding sel diklasifikasikan menjadi bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif.
Pewarnaan negatif
Dalam teknik ini, pewarna kimia digunakan yang tidak menembus bagian dalam sel, tetapi membuat media di mana mikroorganisme muncul sebagai latar belakang hitam.
Dalam teknik pewarnaan negatif, apusan dibuat dengan setetes tinta India atau suspensi nigrosin, yang setelah dibiarkan mengering pada suhu kamar membentuk film buram untuk dilewati cahaya. Dengan cara ini, mikroorganisme muncul sebagai bentuk terang pada latar belakang gelap.
Persiapan
A. Oleskan
1.- Cuci slide dengan baik, keringkan dengan kertas penyerap dan beri label. Label harus menunjukkan isi sediaan, tanggal dan nama orang yang memprosesnya.
2.- Nyalakan korek api dan sterilkan loop inokulasi dalam nyala api sampai merah terang.
3.- Biarkan gagangnya dingin.
4.- Ambil tabung kultur bakteri, lepas tutupnya dan segera lewati mulut tabung di dekat api pembakar (flame).
5.- Masukkan loop inokulasi ke dalam tabung yang berisi kultur bakteri dan ambil sampelnya.
6.- Jika biakan berada dalam media cair, tempatkan sampel yang diambil dengan gagang di tengah kaca objek dan ratakan secara hati-hati dalam lingkaran berdiameter kira-kira 2 cm.
7.- Sterilkan kembali loop inokulasi.
8.- Biarkan apusan mengering di udara.
9.- Ulangi langkah 3 sampai 8 tiga kali.
10.- Jika biakan dalam media padat, setetes air suling sebelumnya harus ditempatkan pada kaca objek. Hal ini dilakukan untuk mencampur sedikit sampel kultur yang diambil dengan loop inokulasi, seperti yang diarahkan pada langkah 2 sampai 5 (kondisi aseptik).
11.- Sebarkan sampel yang telah diencerkan dengan setetes air pada kaca objek dan ulangi sebanyak tiga kali.
B. Fiksasi
1.- Tambahkan dua tetes metanol atau etanol absolut ke apusan kering-dari biakan dalam media cair.
2.- Biarkan mengering di udara dari pemantik api.
3.- Jika apusan berasal dari kultur dalam media padat, apusan kering difiksasi dengan panas, melewatkannya 2 sampai 3 kali dengan cepat melalui bagian terpanas dari nyala api yang lebih ringan.
4.- Sentuh bagian bawah apusan dengan bagian punggung tangan kiri (untuk tangan kanan; jika tidak, gunakan tangan kanan) dan periksa apakah sudah dingin.
C. Pewarnaan sederhana
1.- Tambahkan 2 tetes pewarna yang dipilih ke apusan dan biarkan bekerja selama waktu yang diperlukan dalam protokol khusus untuk setiap noda (umumnya antara 1 dan 5 menit).
2.- Beberapa noda memerlukan penggunaan panas untuk aktivasinya, dalam hal ini seseorang harus sangat berhati-hati saat memanaskan slide dalam nyala api yang lebih ringan (manipulasi dengan pinset dan hindari mendidih ). Overheating smear dapat menghancurkan sel-sel yang akan diamati.
3.- Hapus kelebihan pewarna dengan mencuci dengan air suling dari picette. Hilangkan air cucian dengan mengetuk perlahan slide di tepinya, dimiringkan di atas meja kerja.
4.- Biarkan pengeringan udara.
5.- Tergantung pada jenis pengamatan, kaca penutup digunakan atau tidak pada tahap ini. Coverslip melindungi dan mengawetkan noda. Jika pengamatan minyak imersi dilakukan pada tahap ini, tidak ada kaca penutup yang digunakan tetapi apusan tidak dapat diawetkan.
D. Pelestarian definitif dari noda
1.- Benamkan apusan secara berurutan dalam masing-masing larutan yang ditunjukkan di bawah ini, selama minimal 5 menit. Tujuan dari “mandi” ini adalah untuk membuat apusan benar-benar dehidrasi. Setiap reagen harus dikeringkan dengan baik sebelum memasukkan apusan ke dalam bak berikutnya.
Urutan mandi dehidrasi adalah sebagai berikut:
- Etanol 70%
- 95% etanol
- aseton murni
- Aseton -xylol 1: 1 campuran
- xilol
Kemudian biarkan mengering di udara.
2.- Pasang kaca penutup, sebaiknya 22 × 22 mm, menggunakan balsam Kanada atau media pemasangan lain.
Referensi
- Briggs, G. (1965). Faktor Penyebab Kecelakaan dan Infeksi Laboratorium Mikrobiologi. Laboratorium Biologi Angkatan Darat AS. Benteng Detrik.
- Cappucino, JG dan Welch, CT (2017). Mikrobiologi: Manual Laboratorium. Pearson.
- Holt, Editor JG. (1977). Manual Bergey tentang Bakteriologi Determinatif yang lebih pendek. Baltimore ke- 8 : Williams and Wilkins Co.
- Johnson, TR dan Kasus; KL (2018). Eksperimen Laboratorium dalam Mikrobiologi. Pearson.
- Tille, P. (2017). Mikrobiologi Diagnostik. St. Louis ke- 14 , AS: Elsiever, Inc.
