agar telah standar adalah non – selektif, media kultur padat dirancang untuk kuantifikasi beban hadir mikroba dalam sampel aerobik air minum, air limbah, minuman susu, dan makanan lainnya. Media ini juga dikenal sebagai PCA agar, singkatan dari English Plate Count Agar. Itu dibuat pada tahun 1953 oleh Buchbinder, Baris, dan Goldstein.
Media count agar standar terdiri dari ekstrak ragi, triptein, glukosa, agar, dan air suling . Formulasi ini mengandung unsur nutrisi dasar yang memungkinkan pengembangan beban mikroba aerobik saat ini, tidak menuntut.
Pengenceran desimal untuk menghitung CFU pada jumlah agar standar. Sumber: Quentin Geissmann [CC BY-SA 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)]
Karena media tidak mengandung inhibitor, bakteri dapat tumbuh tanpa batasan apa pun, sehingga ideal untuk penghitungan koloni secara umum. Namun, teknik kuantifikasi plak tidak akan mendeteksi semua bakteri yang ada, tetapi hanya bakteri yang mampu tumbuh di bawah kondisi lingkungan di mana agar-agar hitung standar yang diunggulkan.
Dalam pengertian ini, teknik kuantifikasi pelat umumnya berusaha untuk menentukan jumlah bakteri jenis mesofilik aerobik, yaitu bakteri yang berkembang pada suhu antara 25 dan 40 ° C, dengan suhu pertumbuhan optimal 37 ° C. .
Kelompok bakteri ini sangat penting, karena sebagian besar bakteri patogen bagi manusia terdapat di sana.
Perlu dicatat bahwa terkadang menarik untuk mengukur jumlah bakteri psikrofilik yang ada dalam makanan. Bakteri ini adalah mereka yang berkembang pada suhu rendah (<20 ° C) dan bertanggung jawab untuk menyebabkan makanan membusuk lebih cepat, bahkan ketika didinginkan.
Demikian pula, bakteri termofilik, yang berkembang dalam kisaran antara 50 ° C hingga 80 ° C atau lebih, dapat menjadi penting dalam jenis makanan tertentu seperti makanan kaleng.
Kuantifikasi mikroba dinyatakan dalam unit pembentuk koloni (CFU) per gram atau mililiter sampel.
Indeks artikel
Dasar
Media penghitung standar dirancang untuk memungkinkan pertumbuhan bakteri aerobik non-rewel yang berhasil, karena ekstrak ragi, triptein, dan glukosa menyediakan nutrisi yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroba yang baik.
Di sisi lain, media memiliki warna terang dan tampilan transparan, oleh karena itu sangat ideal untuk visualisasi koloni yang dikembangkan dengan metode deep seeding (penuangan dalam piring).
Penghitungan koloni dengan metode penyemaian permukaan spatula Drigalski juga dimungkinkan.
Ketika beban mikroba tinggi, pengenceran desimal sampel yang diteliti harus dibuat untuk dapat menghitung CFU.
Perlu dicatat bahwa media ini direkomendasikan oleh American Public Health Association (APHA) untuk menghitung mesofil aerobik.
Persiapan
Timbang 23,5 g media dehidrasi dan larutkan dalam satu liter air suling. Untuk larut sepenuhnya, campuran harus dipanaskan dengan sering diaduk sampai mendidih. Langkah-langkah selanjutnya tergantung pada teknik penyemaian yang akan digunakan.
Untuk teknik pelat tuang
Distribusikan dengan menuangkan 12 sampai 15 ml ke dalam tabung reaksi. Selanjutnya disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Biarkan mengeras secara vertikal dalam bentuk balok. Simpan di lemari es sampai digunakan.
Lelehkan steker saat Anda akan menggunakannya. Setelah meleleh, simpan dalam penangas air pada suhu 44-47 ° C sementara sampel disiapkan.
Untuk penaburan permukaan
Mensterilkan media dalam autoklaf pada 121 ° C dan kemudian mendistribusikan 20 ml dalam cawan Petri steril. Biarkan mengeras, balikkan dan simpan di lemari es sampai digunakan.
Pelat temper sebelum digunakan. PH media harus 7,0 ± 0,2.
Menggunakan
Standard Count Agar digunakan dalam teknik penghitungan mesofil aerobik selama analisis mikrobiologis air dan makanan. Jumlah mesofil aerobik diperlukan, karena menentukan kualitas sanitasi sampel yang diteliti.
Penerapan teknik ini (menggunakan media ini) memungkinkan visualisasi makroskopik koloni terisolasi untuk kuantifikasinya.
Teknik tuang piring (deep seeding)
-Proses
Tekniknya terdiri dari sebagai berikut:
1) Homogenkan sampel untuk mendistribusikan kembali bakteri yang ada.
2) Suspensi awal dibuat dalam botol atau kantong steril, dengan memperhatikan perbandingan 10 gr atau 10 ml sampel dalam 90 ml pengencer (10 -1 ).
3) Dari suspensi awal, pengenceran desimal yang bersangkutan dibuat tergantung pada jenis sampel. Contoh: (10 -2 , 10 -3 , 10 -4 ). Pengenceran dibuat dengan air pepton atau buffer fosfat.
Untuk melakukan ini, ambil 1 ml suspensi awal dan masukkan ke dalam 9 ml pengencer, lanjutkan pengenceran jika perlu, sekarang ambil 1 ml pengenceran 10 -2 dan seterusnya.
4) Ambil masing-masing 1 ml pengenceran dan masukkan ke dalam cawan petri kosong yang steril.
5) Tambahkan ke setiap piring 12 sampai 15 ml agar count standar yang sebelumnya dilelehkan dan diendapkan pada 44 – 47 ° C.
6) Putar pelat secara perlahan untuk mendistribusikan sampel di sepanjang agar-agar secara merata dan biarkan hingga mengeras.
7) Balikkan pelat dan inkubasi pada suhu 37 ° C dalam aerobiosis selama 24 hingga 48 jam.
8) Pada akhir waktu, pelat diperiksa dan koloni dihitung dalam pengenceran yang memungkinkan. Pelat yang memiliki antara 30 hingga 300 CFU dipilih untuk penghitungan.
Penghitungan dapat dilakukan secara manual atau Anda dapat menggunakan peralatan penghitung koloni.
Nilai yang diperbolehkan per ml sampel dapat bervariasi dari satu negara ke negara lain tergantung pada peraturan yang mengaturnya.
-Perhitungan UFC
Perhitungan umum dilakukan dengan menggunakan rumus berikut:
Rumus untuk perhitungan umum kuantifikasi CFU. Sumber: Administrasi Obat, Pangan dan Teknologi Medis Nasional (ANMAT). Analisis mikrobiologis makanan, metodologi analitik resmi, mikroorganisme indikator. 2014 Volume 3. Tersedia di: anmat.gov.ar
Nyatakan hasilnya dalam 1 atau 2 digit, kalikan dengan basis 10 yang sesuai. Contoh: jika hasilnya 16.545, maka dibulatkan berdasarkan angka ketiga menjadi 17.000 dan akan dinyatakan sebagai berikut: 1,7 x 10 4 . Sekarang, jika hasilnya adalah 16.436, bulatkan menjadi 16.000 dan nyatakan 1,6 x 10 4 .
Teknik penyemaian permukaan
-Proses
-Inokular dengan 0,1 ml sampel langsung jika cair, suspensi awal 10 -1 atau pengenceran berurutan 10 -2 , 10 -3 dll, di tengah pelat agar hitung standar.
-Distribusikan sampel secara merata dengan spatula Drigalski atau batang kaca berbentuk L. Diamkan selama 10 menit.
-Balikkan pelat dan inkubasi secara aerobik pada suhu 37 ° C selama 24 hingga 48 jam.
-Lanjutkan menghitung koloni, pilih pelat yang berada dalam kisaran antara 20 – 250 CFU.
-Perhitungan UFC
Untuk perhitungan, faktor pengenceran diterapkan, yang merupakan kebalikannya. Angka tersebut dibulatkan menjadi 2 angka penting (pembulatan sesuai dengan angka ketiga) dan dinyatakan dalam pangkat basis 10. Misalnya, jika 224 CFU dihitung dalam sampel tanpa pengenceran (10 -1 ), 22 x 10 1 CFU dilaporkan , tetapi jika angkanya 225, 23 x 10 1 CFU dilaporkan.
Sekarang, jika 199 CFU dihitung dalam pengenceran 10 -3 , 20 x 10 4 CFU akan dilaporkan, tetapi jika 153 CFU dihitung dalam pengenceran yang sama, 15 x 10 4 CFU akan dilaporkan.
QA
Media kultur hitung standar dapat dievaluasi menggunakan galur bersertifikat yang diketahui, seperti: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.
Jika media kultur dalam kondisi optimal, pertumbuhan yang memuaskan diharapkan dalam semua kasus, kecuali untuk L. fermentum, yang dapat menghasilkan hasil yang teratur.
Untuk mengevaluasi sterilitas media kultur, satu atau dua piring dari setiap batch yang disiapkan (tanpa inokulasi) harus diinkubasi pada 37 ° C dalam aerobiosis selama 24 jam. Setelah waktu ini, tidak ada jenis pertumbuhan yang harus diamati, juga tidak boleh ada perubahan warna media yang diamati.
Keterbatasan
-Jangan melelehkan agar-agar lebih dari sekali.
-Media yang telah disiapkan dapat bertahan hingga 3 bulan selama disimpan dalam lemari es dan terlindung dari cahaya.
-Media ini tidak cocok untuk mikroorganisme yang menuntut atau anaerobik.
Referensi
- Administrasi Nasional Obat-obatan, Pangan dan Teknologi Medis (ANMAT). Analisis mikrobiologis makanan, metodologi analitik resmi, mikroorganisme indikator. 2014 Volume 3. Tersedia di: anmat.gov.ar
- Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, SA Plate Count Agar. 2009.Tersedia di: http://f-soria.es
- Laboratorium Conda Pronadisa. Standard Method Agar (PCA) menurut APHA dan ISO 4833. Tersedia di: condalab.com
- Laboratorium Britannia. Jumlah piring agar. 2015.Tersedia di: britanialab.com
- Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B dan Velázquez O. 2009. Teknik untuk Analisis Mikrobiologi Makanan. edisi ke-2 Fakultas Kimia UNAM. Meksiko. Tersedia di: depa.fquim.unam
